单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种在单细胞水平上分析复杂组织转录组的技术，随着scRNA-seq技术的快速发展，研究人员可以利用该技术构建不同肿瘤细胞亚群的转录组数据库，提高我们对肿瘤生物学的基本认识，阐明肿瘤发生和发展的机制，揭示不同肿瘤患者微环境中细胞亚群的异质性，分析免疫细胞浸润程度和肿瘤抗原表达程度。该技术在医学科研领域也表现出了巨大的潜力和影响力，为无实验数据人员发表更多高质量文章，提供了无限可能！
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- 题目：Bulk和单细胞转录组分析了通过YAP/TEAD4/ACADL轴在肝细胞癌中脂质代谢重编程的细胞外基质机械调节
- 杂志：International Journal of Biological Sciences
- 影响因子：IF=9.2
- 发表时间：2023年4月
研究背景
肝癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大常见原因，主要是因为患者在晚期被诊断以及肝癌具有高转移率。作为一种高度异质性的肿瘤，迫切需要更全面地了解HCC细胞增殖失调的分子机制。基质硬度增加是HCC发病率的有力预测因素，但在基质硬度诱导的肿瘤进展过程中发生的代谢过程尚不清楚。因此，作者研究了脂质代谢重编程对基质硬度引发的HCC进展的作用基质，以期为HCC治疗提供了新的治疗靶点。
数据来源
| 数据集/队列 | 数据库 | 数据类型 | 详细信息 |
| TCGA-LIHC | TCGA | RNA-seq数据 | 肝癌转录组数据 |
| GSE14520 | GEO | RNA-seq数据 | 肝癌转录组数据 |
| GSE151530 | GEO | scRNA-seq数据 | 46个肝癌的单细胞数据 |
| 代谢相关基因 | KEGG | 基因集 | 86条代谢途径相关的2886个基因 |
研究思路
使用TCGA-LIHC数据集和GSE14520数据集研究HCC的代谢失调，HCC样本被分为三种具有不同代谢谱的异质性代谢途径亚型：cluster1、2、3。通过单因素COX分析确定了基质硬度和调节脂质代谢的关键酶（ACADL）。通过细胞实验和动物造模验证了ACADL在HCC中的潜在作用。
主要结果
1. Bulk转录组学分析揭示HCC中的代谢失调
为了研究HCC代谢重编程背后的机制，从KEGG数据库中选择了与86条代谢途径相关的2886个基因进行分析，基于基因集变异分析（GSVA）评估TCGA队列每个样本中74条代谢通路的富集分数，其中12条通路由于样本量相对较小而被过滤掉。基于分层聚类结果，将HCC样本分为3个亚型，即cluster 1、2、3（图1A-E）。相比于cluster 3，cluster 1组的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）明显较差（图1F-G）。
图1 Bulk转录组学分析揭示HCC中的代谢失调
2. 基于代谢途径的簇显示出独特的基因组和转录组学特征
绘制火山图展示cluster 1和cluster 3中的差异表达情况（图2A）。接着对每个差异表达基因进行KEGG和REACTOME分析，有丝分裂细胞周期检查站、细胞周期阶段和细胞外基质组织通路在cluster 1中相对富集，而与氨基酸及其衍生物代谢、脂肪酸代谢和细胞色素P450等物质代谢过程相关的基因集在cluster 3中富集（图2B）。KEGG分析结果显示，“细胞周期”和“ECM受体相互作用”在cluster 1中富集，脂质相关代谢途径在cluster 3中富集（图2C-D）。GSEA分析进一步证明，cluster 1中细胞粘附分子、ECM -受体相互作用和Hippo信号通路上调，cluster 3中脂肪酸和胆汁酸相关的代谢途径显著上调（图2E-F）。（ps：功能富集分析、免疫浸润分析也可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据一键出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。
图2 基于代谢途径的簇显示出独特的基因组和转录组学特征
3. 基于单细胞数据鉴定细胞亚型和代谢通路
根据单细胞数据集中的标记，将细胞注释聚类为7种主要细胞类型（图3A）。使用scMetabolism R包以UMAP形式可视化单个细胞的代谢多样性。结果显示，脂肪酸降解途径主要富集于恶性细胞中，而ECM蛋白多糖途径富集于CAFs中（图3B-C）。通过GSVA评估每位患者的通路富集评分。使用相同的聚类方法进行聚类，结果显示所有患者被划分为三个代谢亚型（图3D-E），且脂质代谢途径在恶性细胞和cluster 3中显著富集（图3F-G），与bulk转录组结果一致，即脂肪酸降解可能与CAFs的功能相关。
图3 基于单细胞数据鉴定细胞亚型和代谢通路
4. ACADL作为脂肪代谢的关键酶在HCC中下调
单因素Cox回归分析结果显示，FAO相关基因（ACADL）显著表达（图4A）。与正常肝脏相比，在HCC组织中发现ACADL含量降低（图4B）。相关性热图显示，ACADL与多种CAF和胶原蛋白相关基因呈负相关（图4C）。此外，发现ACADL在各种癌症中表达均显著降低（图4D）；与ACADL高表达的HCC患者相比，ACADL低表达的HCC患者的总生存期和无病生存期较差（图4E-F）。根据有无肝硬化将HCC患者分为两组，肝硬化的患者ACADL表达较低（图4G）。在外部验证集中也发现了同样的结果（图4H-J）。
图4 ACADL作为脂肪代谢的关键酶在HCC中下调
5. 实验证实基质硬度通过YAP-TEAD4-ACADL调节脂质代谢重编程
基质硬度可能会影响脂质代谢，为了验证这一假设，作者进行了细胞实验。将HCC细胞系分别接种在不同硬度基质上，发现高基质硬度的肝癌细胞中游离脂肪酸水平升高(图5B)。与对照组相比，ACADL的mRNA和蛋白表达水平明显下调(图5C-D)。在人类ACADL基因的启动子区域识别了三个保守的TEAD4结合位点（AGCATTCTTT）（图5L），染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR结果显示TEAD4可能结合到ACADL启动子的远端保守位点（R3）（图5M）。
图5 实验证实基质硬度通过YAP-TEAD4-ACADL调节脂质代谢重编程
6. 软基质增加体内ACADL的mRNA和蛋白表达水平
动物实验流程如图6A，结果显示，BAPN组肿瘤体积明显小于对照组（图6B-C）。另外，对照组肿瘤重量明显大于BAPN组（图6D）。羟基脯氨酸分析显示，与PBS对照组相比，BAPN组胶原含量显著降低（图6E）。BAPN组肿瘤组织中ACADL的mRNA和蛋白水平高于PBS对照组（图6F-G）。
F
G
图6 软基质增加体内ACADL的mRNA和蛋白表达水平
文章小结
这篇文章利用转录组结合单细胞的多组学分析形式，基于代谢通路评分对肿瘤进行分型，同时加上实验验证，干湿结合，并且实验验证由细胞实验和动物造模双重buffer加持，发到9分+可谓是当之无愧！“干湿结合”目前已经是大势所趋，小伙伴们赶快码起来吧，高分文章在向你招手！（PS：如果你还苦恼于生信分析没有思路，或者嫌分析方法太过简单、太过老套，想要创新思路的，或者对多组学联合分析/代谢方向感兴趣的小伙伴直接扫码联系小云吧！）
小云有话说
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