细胞死亡生信OUT了？常规肿瘤预后思路OUT了？
细胞死亡+肿瘤预后思路玩腻了？
那是单一细胞死亡形式的简单预后思路烂大街了，可不能把“细胞死亡”这个大热点一棒子打死，它的生信发文能力还是有目共睹的！目前形势下怎么发高分才是我们要重点关注的点，小云带小伙伴们从最新文献中寻找突破口~
来看这篇由哈尔滨医科大学肿瘤医院刘芳教授团队最新发表的7.9分文章，细胞死亡方向，还是肺腺癌预后，这种经典大癌种预后分析还能发到接近8分的水平，咱们得好好看看这篇文章是怎么应用“细胞死亡”的：
1）选题创新：集合了15种常见细胞死亡形式，从选题上就赢了单一细胞死亡分析一大截（ps：这个选题与小云前面分享过的18种细胞死亡纯生信分析有异曲同工之处，感兴趣的小伙伴可以点击文末链接观看哦）；
2）数据量大、分析方法多样化：应用6个bulk-RNA seq数据集和1个scRNA-seq数据集，并且进行了单细胞分析；
3）干湿结合：利用细胞和临床组织样本进行关键基因的表达和功能验证。
这篇文章最大的亮点就是“集合15种细胞死亡”的选题，所以只要细胞死亡用的好，即使是做肺癌等大癌种预后分析也发到1区接近8分的文章！想要继续再“细胞死亡”方向添一把火的朋友，可以复现这个创新性和内容丰富度俱佳但分析难度又不大的思路，并且干湿结合是审稿人比较喜欢的类型，更容易发高分哟！想复现/设计思路或定制生信分析的朋友，欢迎扫码联系小云~
- 题目：不同细胞死亡模式对肺腺癌预后和免疫的影响
- 杂志：NPJ Precis Oncol.
- 影响因子：IF=7.9
- 发表时间：2023年11月
研究背景
近年来，肺腺癌(LUAD)由于其对治疗的低反应性、不良预后以及缺乏预测LUAD进展或治疗效果的可靠指标而成为关注的焦点。不同的细胞死亡模式在肿瘤发展中起着至关重要的作用，并有望预测LUAD的预后。
数据来源
| 数据集 | 来源 | 数据类型 | 样本信息 |
| TCGA-LUAD | TCGA | RNA-seq数据+临床信息 | 439名LUAD患者 |
| GSE37745 | GEO | RNA-seq数据+临床信息 | 196名LUAD患者 |
| GSE68465 | GEO | RNA-seq数据+临床信息 | 442名LUAD患者 |
| GSE135222 | GEO | RNA-seq数据+临床信息 | 27名LUAD患者 |
| GSE78220 | GEO | RNA-seq数据+临床信息 | 27名LUAD患者 |
| IMvigor210 | RNA-seq数据+临床信息 | 348名LUAD患者 | |
| GSE171145 | GEO | scRNA-seq数据+临床信息 | 9个LUAD患者的单细胞样本 |
| 细胞死亡基因集 | MsigDB、KEGG、Genecards、文献 | 15种细胞死亡形式共3925个调控基因 | |
研究思路
作者首先基于TCGA-LUAD队列使用单变量Cox回归筛选15种细胞死亡类型的预后相关基因，然后使用LASSO分析进一步筛选与LUAD预后紧密相关的细胞死亡相关基因，并将其纳入多变量Cox回归模型，以分别建立15种细胞死亡的风险评分模型。根据风险评分临界值将患者分为高低风险组，筛选两组间的差异基因。利用ROC曲线的AUC值评估15种细胞死亡相关特征的预测可靠性，并选择了AUCs >0.7的细胞死亡相关风险评分模型，将它们配对，最终得到28种细胞死亡组合类型，再基于AUC值选择坏死性凋亡+免疫细胞死亡组合作为最佳细胞死亡指数(CDI)特征，用于预测LUAD患者的预后。对比CDI模型与其他15种模型的AUC值，利用KM曲线分析OS与CDI模型、坏死性凋亡和免疫细胞死亡的相关性。Cox回归分析CDI特征与临床变量的相关性并建立列线图。将CDI特征与其他已发表的预后模型进行比较，分析其与免疫浸润的相关性并评估高低CDI组间的免疫治疗反应。利用单细胞数据分析了LUAD中的免疫特征并在单细胞水平上分析CDI特征基因的细胞亚型分布和表达。最后，在临床组织样本中验证关键基因表达，并利用CCK-8、EDU分析、伤口愈合实验等细胞实验检测其功能。
主要结果
1. LUAD预后相关细胞死亡基因死亡筛选
首先基于TCGA-LUAD队列使用单变量Cox回归筛选15种细胞死亡类型的预后相关基因，然后使用LASSO分析进一步筛选与LUAD预后紧密相关的细胞死亡相关基因。将各细胞死亡类型的预后相关基因纳入多变量Cox回归模型，分别建立15种细胞死亡的风险评分模型。根据各风险评分的临界值将患者分为高低风险组，筛选两组间的差异表达的细胞死亡基因，并使用多变量Cox回归分析这些基因与LUAD预后的关系（图1）。结果显示，比如包括TPM2、PPP1R3G、IGF2BP1、ID1、HNRNPF和CCT6A在内的坏死性凋亡相关基因在高危人群中显著表达，表明这些基因在癌症发展和进展中起着潜在的关键作用。
图1 LUAD预后相关细胞死亡基因死亡筛选
2. CDI特征的建立和验证
首先计算并比较了15种细胞死亡特征的1年、2年、3年、4年和5年AUC值（图2a，b），为了探索具有最高AUC值的组合细胞死亡相关特征，作者又评估了一系列由不同细胞死亡类型组合组成的候选模型，结果发现坏死性凋亡+免疫细胞死亡特征组合具有最高AUC值，将其称之为细胞死亡指数(CDI)特征，具有更高的预测性能，ROC曲线也支持这一结果（图2a-d）。分别基于CDI、坏死性凋亡和免疫细胞死亡评分，将LUAD患者分为高、低风险组，进行KM生存分析。结果显示，与免疫原性细胞死亡和坏死性凋亡特征相比，通过CDI特征分层的高风险组和低风险组之间存在更显著的预后差异（图2e-g）。并且基于UMAP的基因分类结果也显示，通过CDI特征分层的高风险组和低风险组可以明显分析（图2h-j）。
图2 CDI特征的建立和验证
3. 列线图构建以及CDI特征与其他已发表的预后生物标志物的比较
为了研究CDI特征与临床变量的相互作用，作者进行了单变量和多变量Cox回归，发现CDI和N分期是OS的独立预后因素（图3a，b），随后结合临床因素，包括CDI和N分期，建立了一个列线图并通过ROC曲线评估其预测性能（图3c，d）。此外，作者从前期研究中选择了四个模型（坏死性凋亡特征、ICD特征、焦亡特征和铁死亡特征）与CDI特征进行比较，显示CDI特征的1-5年AUC值显著高于四个已发表特征的AUC值（图4c），并且CDI特征的C指数最高（图4d）。
图3 独立预后分析的列线图构建
图4 CDI特征与其他模型比较
4.免疫浸润分析
作者利用MCP counter比较高和低CDI组中8种免疫细胞和2种基质细胞的浸润水平，显示T细胞、B细胞、髓样树突细胞、中性粒细胞和内皮细胞的绝对丰度分数在低CDI组中具有统计学意义，而成纤维细胞的绝对丰度分数在高CDI组中具有统计学意义（图5a，b）。然后使用CIBERSORT算法来检查高CDI组和低CDI组在免疫细胞浸润方面的差异，结果显示肥大静息细胞、幼稚B细胞和CD4+记忆静息T细胞主要富集在低CDI组（图5c）。CIBERSORT算法研究CDI与22种免疫细胞的关系，发现CD4 +记忆激活T细胞、巨噬细胞M0和M1、肥大细胞激活细胞和NK静息细胞的浸润水平与CDI正相关（图5d）。（ps：多种免疫浸润分析等都可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现哦，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）
图5 免疫浸润分析
5. 免疫治疗反应分析
作者首先比较高低CDI组间的TIDE评分，显示低CDI组的TIDE评分明显低于高CDI组，且CDI与TIDE评分呈正相关（图6a，b）。在接受免疫治疗LUAD患者的GSE135222数据集中检测预后和CDI特征之间的关系，KM曲线显示低CDI组的总生存率高于高CDI组(图6e)。随后，比较了高CDI组和低CDI组中应答者和无应答者的比例，以及免疫治疗应答者和无应答者之间的CDI差异，结果发现，低CDI组的应答率显著较高但反应患者和无反应患者之间的CDI值没有显著性（图6f，g）。比较高CDI组和低CDI组间免疫表型评分(IPS)以及免疫检查点抑制剂(包括抗PD1/PDL1/PDL2、抗CTLA4以及两种治疗)的差异，结果均显示其在低CDI组相对较高(图6n)。
图7 免疫治疗反应评估
6. 单细胞分析
作者基于单细胞数据集GSE171145使用t-SNE方法根据标准标记基因的表达水平，将所有免疫细胞分为10种细胞类型，包括T细胞、单核细胞、B细胞、上皮细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、肥大细胞、成纤维细胞、内皮细胞和DC细胞（图S4a）。此外，计算了坏死性凋亡和ICD的风险评分，显示了不同细胞类型之间的显著差异（图S4c）。大多数坏死性凋亡和ICD相关的模型基因通常在每个细胞亚型中表达，并且模型基因在不同细胞亚型中的表达值差异进一步说明了LUAD微环境中的异质性（图S4d）。
图S4 单细胞分析
7. 关键基因的验证
为了进一步验证CDI信号的性能，作者分别选择了对坏死性凋亡和免疫原性细胞死亡相关风险模型贡献最大的HNRNPF和FGF2进行验证。首先收集五对临床LUAD标本，WB验证HNRNPF和FGF2的表达，显示HNRNPF和FGF2在大多数肿瘤组织(T)中的表达升高（图8a）。随后在HBE和不同肺癌细胞系中WB验证HNRNPF和FGF2的表达水平，并在HNRNPF高表达的H1299细胞和FGF2高表达的A549细胞进行了敲除分析（图8b，c）。CCK-8分析和EDU分析的结果证明HNRNPF和FGF2的敲低明显抑制肺癌细胞增殖(图8d，e)，伤口愈合试验表明，在敲除HNRNPF和FGF2后，细胞的迁移受到抑制(图8f)。由于化疗经常导致各种细胞死亡，作者又检测了顺铂对坏死性凋亡的影响以及奥沙利铂对ICD的影响。结果表明顺铂刺激H1299细胞中的坏死性凋亡，敲低HNRNPF进一步增加顺铂诱导的坏死性凋亡(图8g)，奥沙利铂促进A549细胞中ICD相关蛋白(P-eIF2α)的表达，FGF2的敲除进一步增强奥沙利铂诱导的ICD(图8h)。
图8 关键基因的验证
文章小结
“细胞死亡”用的好，高分文章跑不了！这篇文章基于新颖的选题和大数据量以及丰富的分析内容拿下1区接近8分的文章的实力是毋庸置疑的，也正是因为此才可以在肺腺癌这样文章满天飞的大癌种中获得一席之地。小伙伴们，“细胞死亡”大方向仍是国自然和生信的大热点，想要分一杯羹的朋友，小云建议你复现这个创新性和内容丰富度俱佳但分析难度又不大的思路，并且干湿结合是审稿人比较喜欢的类型，更容易发高分哟！需要思路复现、设计、定制分析的小伙伴快扫描下方二维码联系小云吧，早上车早发文哟~
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