在前面的文章中，小果向大家分享了单细胞测序的流程，想必小伙伴们也成功的学会了湿实验的步骤吧。但是湿实验的结束才是整个生信项目的开始，面对着测序仪下机的原始数据，很多小伙伴可能感觉无从下手，不知道怎么对数据进行分析。这一次小果就跟大家分享一下怎么阅读从测序仪得到的FASTQ文件，大家快来看看吧！
什么是FASTQ文件？
FASTQ（Fast Quality）文件是一种常用的存储测序数据的文本格式，文件后缀通常为.fastq或.fq。它通常用于存储高通量测序（如DNA测序或RNA测序）得到的原始测序片段（reads）的序列和对应的质量信息。
FASTQ文件的每个测序片段通常由四行组成，具体格式如下：
- 第一行以符号 “@” 开头，后接一个唯一的标识符，表示该序列的名称或编号。
- 第二行是对应测序片段的碱基序列，由A、T、C、G等碱基字符组成。
- 第三行以符号 “+” 开头，通常跟随着与第一行相同的标识符，用于可选的描述性信息（在一些情况下可以忽略）旧版FASTQ格式中会在这一行重复第一行信息，现在为节约存储，一般是不再加重复信息。
- 第四行是与第二行对应的质量值序列，这一行信息至关重要，通常使用ASCII编码表示，每个字符对应一个测序片段中对应位置的质量值。
这个FASTQ文件是小果在一次DNA测序后从测序仪直接得到的下机数据。以这个文件为例，小伙伴们是不是已经理解了每个片段的前三行呢？接下来小果就详细给大家解释一下第四行质量值的阅读方法。
什么是质量值Q和质量分数Phred？
质量值Q表示了测序片段中每个碱基的可信度，碱基质量值Q计算公式：
其中p为碱基被识别错误的概率。根据公式计算所得Q值越高，代表碱基被测错的概率越小。例如测序数据下机质量评价指标中，Q20，Q30，Q40就分别代表测序错误率为1%，0.1%，0.01%。下机数据Q30 >85%，代表所有下机数据当中测序错误率小于0.1%的碱基占总碱基数的比例超过85%。
Phred质量分数是一个负数，代表着错误的概率，一般在0到41之间（ASCII编码的范围是33-73），较低的质量分数表示较高的错误概率。
为了对碱基质量值进行准确记录并节约存储，采用ASCII表对碱基质量值进行转换。对应转换方式比较常见的有Phred33和Phred64两种不同的质量体系。
Phred33：从ASCII码表可打印的字符开始，将质量值0~40对应转换为ASCII值33到73对应的控制字符“！”~“I”： （即用“实际碱基质量值+33”所得数值对应的ASCII码表中的控制字符代表该碱基质量值）
Phred64： 用“实际碱基质量值+64” 所得数值对应的ASCII码表中的控制字符代表该碱基质量值。
其他质量值体系如Solexa+64等的质量值与控制字符的对应关系见以下图示。
需要注意的是，由于FASTQ文件的体积通常较大，在处理和传输时需要考虑存储空间和计算资源的限制。
看到这里，小果相信大家已经掌握了如何阅读FASTQ文件，但是可能还有小伙伴们会有疑问，FASTQ文件可以进行什么处理呢？能够变成什么文件呢？与其他文件类型有什么关系呢？不要心急，小果这就给大家娓娓道来。
FASTQ文件后续如何处理？
初入生信的小伙伴们可能听说过FASTA文件（.fasta/.fa)，与FASTQ名称有八成甚至九成的相似，可能很多小伙伴都不太能分清他们，现在就让小果用“照妖镜”揭开FASTQ文件的朋友们的神秘面纱吧：
举一个FASTA文件的例子：
相信聪明的小伙伴们已经看出来了，其实FASTA文件就是FASTQ文件的序列值部分，即FASTQ文件每个序列的前两行。正如上面所说，由于FASTQ文件的体积通常较大，在处理和传输时需要考虑存储空间和计算资源的限制，因此FASTQ文件经常需要转化成体积更小的FASTA文件。将FASTQ转换为FASTA格式，即把FASTQ中的序列行取出的过程就叫做序列拼接。这样得到了忽略质量值的FASTA文件，是为了适用于某些序列分析和比对算法。
那么FASTA文件又可以如何接着处理呢？在本系列教程的后面，我们还会继续接触序列比对、变异检测等等操作，这些操作也都会生成各种文件类型，小果在这里就一次性满足小伙伴们的好奇心，继续往下展开分享吧~
使用短序列比对算法（例如Bowtie、BWA等）将FASTQ文件比对到参考基因组或其他序列库上，生成的比对结果文件通常是SAM（Sequence Alignment/Map）或BAM（Binary Alignment/Map）格式。这些文件包含了每个测序 read 的比对位置、序列以及其他相关信息。SAM文件是文本格式，BAM文件是其二进制形式。SAM/BAM文件的主要应用是存储和传输测序数据比对到参考基因组（或转录组）的结果。这些文件包含了每个测序read的比对位置、比对质量、序列信息等重要信息。关于SAM/BAM文件的详细信息，小果会在后面的教程中给大家娓娓道来。
到这里还远远不是生信分析的尽头。SAM/BAM文件是存储测序数据比对结果的标准格式，广泛应用于测序数据分析、基因组注释和变异检测等领域。例如：
- 对比对结果进行变异检测时，可以将SAM/BAM文件与参考基因组进行比较，识别出测序样本中与参考基因组不同的变异位点，并生成Variant Call Format（VCF）文件。
- 根据SAM/BAM文件的覆盖程度和特征，可以生成BED（Browser Extensible Data）文件，用于表示基因组区域的注释、染色体结构变异等信息。
- 将比对结果（SAM/BAM文件）与注释数据库（如基因组注释数据库）结合，生成GTF（Gene Transfer Format）或GFF（General Feature Format）文件，用于描述基因和转录本的结构、外显子、内含子等信息。
- 为了快速访问和检索BAM文件中的比对结果，可以对BAM文件进行索引构建。索引文件提供了一种快速查询特定区域的机制，避免了需要逐行扫描整个BAM文件的时间消耗。目前常见的BAM索引文件格式有.BAI（Binary Alignment/Map Index）和.CSI（Coordinate-sorted Binary Index）两种格式。
为了方便大家记忆，小果自制一张思维导图，欢迎大家收藏哦~
顺带一提，小果在可视化时喜欢使用IGV软件，一般就需要用到.BAI文件。后面小果也会专门出一期教程给大家分享如何使用IGV，小伙伴们记得持续关注哦。
怎么样，相信聪明的大家已经掌握了怎么处理FASTQ文件的内容，是不是很简单呢？其实生信中很多东西都是这样，第一次接触时看上去有点复杂，但只要稍加学习和思考就可以轻易掌握，小果相信大家只要在生信这条路上坚持地走下去，不远的未来都可以成为生信大牛！相信小伙伴们已经摩拳擦掌，迫不及待地想要开启生信分析流程啦，大家可以继续关注小果接下来的内容，小果会全面并且详细地分享生信分析接下来的流程哦。
如果小伙伴们平时在生信分析的操作过程中遇到困难，欢迎大家使用小果开发的生信工具平台http://www.biocloudservice.com/home.html，大家在新接触一个知识的时候，与其先花费大量时间死啃知识点，不如先利用好工具先自己上手接触流程，在跑完一遍全流程后再返回去理解知识点，相信可以更好更快地理解，达到事半功倍的效果！
下一次，小果就跟大家分享如何在五分钟内完成FASTQ文件的质量评估，小伙伴们记得持续关注哦。