10×genomics因其分选细胞效果好，通量高等优点已成为主流的单细胞测序平台。
小果上期对它的原理进行了介绍，感兴趣的小伙伴可以去看。这期小果将介绍10×genomics单细胞测序分析环境的搭建与用10×平台官方出的数据处理流程Cell Ranger进行数据处理与count表达矩阵的生成。
通常这是单细胞分析的整个流程。
与许多组学分析一样，先将FASTQ文件比对，转换为二进制的BAM文件，然后进行基因表达计数。拿到表达矩阵后才能进行下一步的分析。
今天小果带大家完成流程的搭建与上游的的数据处理。就是这张图上面三个步骤。
一、准备工作
（一）软件安装
1.CellRanger
Cell Ranger是10×genomics官方出的数据处理分析工具，它的适配度好，功能强大，操作简单等优点，成为了单细胞测序数据分析的必备工具。
在获得单细胞的测序数据后，使用Cell Ranger来进行数据的处理与分析的工作流程。
What is Cell Ranger? -Software -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support
上面是10×genomics测序平台Cell Ranger主页链接，详细介绍了Cell Ranger是什么与怎么用。
下载需要填写信息完成注册。
复制下载链接到linux命令行，运行并下载
#随后解压缩下载的软件包
tar -zxvf cellranger-7.1.0.tar.gz
在命令行敲一下，ok，软件安装好了。
Loupe Browser
Loupe Browser是一个桌面应用程序，提供交互式可视化分析来自不同 10x 基因组学解决方案的数据的功能。它能轻松查询 10x 基因组学数据的不同视图快速深入了解数据。 
下载仍然需要填写一次信息。填写好信息后便可以下载。
在windows系统下打开安装包，进行安装即可。
这是应用的界面
3.bcl2fastq
是illumina平台内置的一个软件，Cell Ranger没有集成这个软件，我们需要自己去下载。有了这个软件之后，Cell Ranger可以完成从bcl测序文件，到最后结果生成，一条龙式地完成。
bcl2fastq and bcl2fastq2 Conversion Software Downloads (illumina.com.cn)
bcl2fastq的网站
同样需要注册填写信息，就可以进一步安装了
https://support.illumina.com.cn/content/dam/illumina-support/documents/downloads/software/bcl2fastq/bcl2fastq2-v2-18-0-12-tar.zip
这里贴上下载的地址
#解压缩
unzip bcl2fastq/bcl2fastq2-v2-18-0-12-tar.zip
tar -zxvf bcl2fastq/bcl2fastq2-v2-18-0-12-tar.gz
#编译软件
cd bcl2fastq2
chmod ugo+x src/configure
chmod ugo+x src/cmake/bootstrap/installCmake.sh
mkdir bin
cd bin
../src/configure –prefix=${PWD}/bin
make
make install
4.创建conda环境安装软件
#安装mamba
conda install -y mamba
#创建虚拟环境
conda crate -n -y singlecell
#激活环境
conda activate singlecell
#下载软件
mamba install -y fastqc
mamba install -u multiqc
mamba install -y fastp
mamba install -y star
mamba install -y bioconductor-singler
mamba install -y samtools
mamba install -y featurecounts
mamba install -y r-seurat
mamba install -y umi_tools
数据下载
参考序列下载
#人基因组
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
#小鼠基因组
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
#人和小鼠混合
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-and-mm10-2020-A.tar.gz
#Sample Index Set Sequences
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/chromium-shared-sample-indexes-plate.csv
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/chromium-single-cell-sample-indexes-plate-v1.csv
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/gemcode-single-cell-sample-indexes-plate.csv
2.练习数据下载
#pbmc 1k数据
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_fastqs.tar
1000个单细胞的测序数据
使用cellranger分析单细胞数据
Basecalling
1.将测序原始数据bcl文件转换为fastq文件
#案例数据，illuminca测序原始数据
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv
tar -zxvf cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
这是这个原始测序数据所包含的内容，数据在这个Data目录下面。
simple文件是个表格。这个案例数据只有一个样本。1代表第一个样本，然后样本名，最后是Index号码。
cellranger mkfastq –id=output –run=cellranger-tiny-bcl-1.2.0 –csv=cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv –localcores=12 –localmem=32
使用cellranger mkfastq软件
–id: 输入的文件夹
–run: 输入的文件
–csv: 数据的列表
–localcores: 控制CPU核心数
–localmem: 控制内存数目
非常简单，只要输入文件，及输出的文件夹就行了。因为数据很小，很快就运行好了。
生成的fastq就在这个文件夹里。
Test_sample就是最终的结果。文件名会根据simple文件的名称命名。
打开第一个看一下，其为Index序列。
Read1为barcod+UMI
Read2是真正的我们想要的测序序列。
该部分为演示如何将bcl转化为fastq。
质控
接下来我们对练习数据进行处理，这里我们打开案例的数据。使用通配符*匹配所有fastq的read2。然后进行质控。
#对read2 进行质控
ll pbmc_1k_v3_fastqs/pbmc_1k_v3*_R2_001.fastq.gz
fastqc -t 12 -f fastq -o qc1 pbmc_1k_v3_fastqs/pbmc_1k_v3*_R2_001.fastq.gz
质控结果，显示测序数据质量较好。
10×genomics的测序数据通常质量较好，所以绝大部分不用进行质控以及过滤。
实在过滤的话呢，由于read1和read2不一样，前者是barcode，后者是测序数据，对测序数据过滤掉以后，二者索引不匹配，引起操作麻烦。
生成表达矩阵
Cellranger count的选项参数，该软件主打的就是一个简单方便，用起来简单绝对是个优点。
输入前面三个参数就可以工作了。
#计算count 矩阵，pbmc 1000个细胞，等号之间不要有空格
cellranger count –id=run_count_1kpbmcs –fastqs=pbmc_1k_v3_fastqs –sample=pbmc_1k_v3 \
–transcriptome=refdata-gex-GRCh38-2020-A/ \
–localcores=12 –localmem=32
设置输入输出，剩下的按照默认的就行了。
这样它就运行起来了。
最终的结果在outs里面
小果今天的讲解就到这里了~下期我将会带来对单细胞测序分析结果的解读~我们不见不散
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