scMerge2魔法指南：小果带你领略单细胞数据融合的奇妙之旅！

前言

单细胞多样本整合工具大家也学过很多了吧！但是除了 Seurat、SAUCIE 和 Scanorama 之外，其他几种快速程序（deepMNN、BBKNN、Harmony、scVI、scANVI 和 DESC）都侧重于提取联合嵌入，而不返回调整后的基因表达矩阵。随着对样本水平分析的需求日益增长，缺乏调整后的表达矩阵限制了此类综合结果的利用，削弱了其有效性和普适性。因此，下一代图集级整合算法应能整合大量研究，生成共识细胞类型图和调整表达矩阵，以便进一步进行下游分析。为此， scMerge2应运而生，这是一种可扩展的高容量算法，可对图集规模的多样本多条件单细胞研究进行数据整合。下面跟着小果来学习一下吧！

scMerge2介绍

scMerge 算法可去除批次效应，并对单细胞 RNA-Seq 数据进行归一化处理。它由三个关键部分组成，包括

• 确定稳定表达基因（SEG）作为 “阴性对照”，以估计不需要的因素；

• 构建伪重复，以估计不需要的因素的影响；

• 使用快速 RUVIII 模型调整存在不必要变异的数据集。

scMerge2示例

安装R包

scMerge可在bioconductor （https://bioconductor.org/packages/scMerge） 上使用。您可以使用以下方法安装它：

## 从 Bioconductor 安装 scMerge，需要 R 3.6.0 或以上版本

BiocManager::install(“scMerge”)

##您也可以尝试安装 ScMerge 的 Bioconductor 开发版

BiocManager::install(“scMerge”, version = “devel”)

加载包和数据

suppressPackageStartupMessages({

library(SingleCellExperiment)

library(scMerge)

library(scater)

})

我们在R包中提供了一个小鼠胚胎干细胞（mESC）数据示例，以及一组预先计算好的稳定表达基因（SEG）列表，用作阴性对照基因。

完整的、未经规范化的 mESC 数据可在这里找到（https://www.maths.usyd.edu.au/u/yingxinl/wwwnb/scMergeData/sce_mESC.rda）。R包附带了该数据的子样本、两个批次版本（命名为“batch2”和“batch3”，以便与完整数据保持一致）。

## 小鼠 ESC 数据子集

data(“example_sce”, package = “scMerge”)

data(“segList_ensemblGeneID”, package = “scMerge”)

在这个 mESC 数据中，我们汇集了来自三种不同细胞类型的两个不同批次的数据。通过 PCA 图，我们可以看到，尽管细胞类型有很强的分离性，但批次效应也造成了很强的分离性。

example_sce = runPCA(example_sce, exprs_values = “logcounts”)

scater::plotPCA(example_sce,

colour_by = “cellTypes”,

shape_by = “batch”)

无监督 scMerge2

在无监督情况下，我们将对每个批次中的共享近邻图进行图聚类，以获得伪副本。这需要用户提供一个向量，其中包含每个批次中构建最近邻图时的邻图数量。默认情况下为10。

scMerge2_res <- scMerge2(exprsMat = logcounts(example_sce),

batch = example_sce$batch,

ctl = segList_ensemblGeneID$mouse$mouse_scSEG,

verbose = FALSE)

assay(example_sce, “scMerge2”) <- scMerge2_res$newY

set.seed(2022)

example_sce <- scater::runPCA(example_sce, exprs_values = ‘scMerge2’)

scater::plotPCA(example_sce, colour_by = ‘cellTypes’, shape = ‘batch’)

半监督scMerge2

scMerge2_res <- scMerge2(exprsMat = logcounts(example_sce),

batch = example_sce$batch,

cellTypes = example_sce$cellTypes,

ctl = segList_ensemblGeneID$mouse$mouse_scSEG,

verbose = FALSE)

assay(example_sce, “scMerge2”) <- scMerge2_res$newY

example_sce = scater::runPCA(example_sce, exprs_values = ‘scMerge2’)

scater::plotPCA(example_sce, colour_by = ‘cellTypes’, shape = ‘batch’)

scMerge2 的更多详细信息

每个单元格分组内构建的伪块数量默认设置为 30。数字越大，模型估算中的伪块数据就越多，估算时间也就越长。

scMerge2_res <- scMerge2(exprsMat = logcounts(example_sce),

batch = example_sce$batch,

ctl = segList_ensemblGeneID$mouse$mouse_scSEG,

k_pseudoBulk = 50,

verbose = FALSE)

assay(example_sce, “scMerge2”) <- scMerge2_res$newY

set.seed(2022)

example_sce <- scater::runPCA(example_sce, exprs_values = ‘scMerge2’)

scater::plotPCA(example_sce, colour_by = ‘cellTypes’, shape = ‘batch’)

在处理大量数据时，我们可以每次获取较小单元格子集的调整后矩阵。这可以通过在in函数中设置，函数将不返回调整后的整个矩阵，而是输出估计值。然后，为了使用估计值得到调整后的矩阵，我们首先需要对对数矩阵进行余弦归一化处理，然后计算余弦归一化矩阵的行向（基因向）平均值（这是因为默认情况下，在步骤之前会对对数归一化矩阵进行余弦归一化处理）。然后，每次我们都可以用它来调整单元格子集的矩阵。

scMerge2_res <- scMerge2(exprsMat = logcounts(example_sce),

batch = example_sce$batch,

ctl = segList_ensemblGeneID$mouse$mouse_scSEG,

verbose = FALSE,

return_matrix = FALSE)

cosineNorm_mat <- batchelor::cosineNorm(logcounts(example_sce))

adjusted_means <- DelayedMatrixStats::rowMeans2(cosineNorm_mat)

newY <- list()

for (i in levels(example_sce$batch)) {

newY[[i]] <- getAdjustedMat(cosineNorm_mat[, example_sce$batch == i],

scMerge2_res$fullalpha,

ctl = segList_ensemblGeneID$mouse$mouse_scSEG,

ruvK = 20,

adjusted_means = adjusted_means)

}

newY <- do.call(cbind, newY)

assay(example_sce, “scMerge2”) <- newY[, colnames(example_sce)]

set.seed(2022)

example_sce <- scater::runPCA(example_sce, exprs_values = ‘scMerge2’)

scater::plotPCA(example_sce, colour_by = ‘cellTypes’, shape = ‘batch’)

scMerge2 为需要通过函数进行多级调整的数据整合提供了分级合并策略。例如，对于有多个样本的数据集，我们可能希望先消除数据集内部的样本效应，然后再与其他数据集整合。下面，我们将说明如何建立分层合并顺序，作为scMerge2h()scMerge2h() 的输入。

为了便于说明，我首先为样本数据创建了一个假样本信息。现在，每个批次都有两个样本。

# 创建一个假样本信息

example_sce$sample <- rep(c(1:4), each = 50)

table(example_sce$sample, example_sce$batch)

要执行合并，我们需要创建一个分层索引列表scMerge2h

1.一个分层索引列表，表示要合并的单元格的索引；

2.一个批次信息列表，表示每次合并的批次信息。

场景1

我们将首先说明两级合并的情况，其中第一级是指在每一批中去除样本效应，第二级是指两批的合并。

首先，我们将构建分层索引列表。分层索引列表是一个列表，它指出了每一层中哪些单元格的索引要进行合并。列表元素的数量应与合并层级的数量相同。对于每个元素，它应包含每个合并单元的索引向量列表。

# 构建分层索引列表

h_idx_list <- list(level1 = split(seq_len(ncol(example_sce)), example_sce$batch),

level2 = list(seq_len(ncol(example_sce))))

在第 1 层，我们将执行两次合并，每一批合并一次。因此，我们有一个由两个索引向量组成的列表。每个矢量表示各批次单元格的索引。

h_idx_list$level1

在第 2 层，我们将执行一次合并，合并两批数据。因此，我们有一个索引向量列表，表示完整数据中所有单元格的索引。

h_idx_list$level2

接下来，我们需要创建批次信息列表。

# 构建批次信息列表

batch_list <- list(level1 = split(example_sce$sample, example_sce$batch),

level2 = list(example_sce$batch))

我们可以看到标有合并级别的batch_list。

batch_list$level1

现在，我们可以输入and来分层合并数据。我们还需要输入 a ，它是每个合并层级的无用变异数（RUV 模型中为 k）的向量。我们建议在第一层输入较低的。在这里，我们将 RUV 的 k 设置为第一层为 2，第二层为 5。batch_listh_idx_listscMerge2hruvK_listruvKruvK_list = c(2, 5)

scMerge2_res <- scMerge2h(exprsMat = logcounts(example_sce),

batch_list = batch_list,

h_idx_list = h_idx_list,

ctl = segList_ensemblGeneID$mouse$mouse_scSEG,

ruvK_list = c(2, 5),

verbose = FALSE)

scMerge2h 的输出是一个矩阵列表，显示每一级调整后的矩阵。

length(scMerge2_res)

lapply(scMerge2_res, dim)

在此，我们将使用上一级的调整矩阵作为最终调整矩阵。

assay(example_sce, “scMerge2”) <- scMerge2_res[[length(h_idx_list)]]

set.seed(2022)

example_sce <- scater::runPCA(example_sce, exprs_values = ‘scMerge2’)

scater::plotPCA(example_sce, colour_by = ‘cellTypes’, shape = ‘batch’)

场景2

scMerge2h 可以处理灵活的合并策略输入。例如，在上述第 1 层，我们只能合并一个批次的数据。例如，我们可以从修改批次索引列表和分层索引列表开始，删除第 1 层的第 2 批列表。

h_idx_list2 <- h_idx_list

batch_list2 <- batch_list

h_idx_list2$level1$batch2 <- NULL

batch_list2$level1$batch2 <- NULL

print(h_idx_list2)

print(batch_list2)

scMerge2_res <- scMerge2h(exprsMat = logcounts(example_sce),

batch_list = batch_list2,

h_idx_list = h_idx_list2,

ctl = segList_ensemblGeneID$mouse$mouse_scSEG,

ruvK_list = c(2, 5),

verbose = FALSE)

assay(example_sce, “scMerge2”) <- scMerge2_res[[length(h_idx_list)]]

set.seed(2022)

example_sce <- scater::runPCA(example_sce, exprs_values = ‘scMerge2’)

scater::plotPCA(example_sce, colour_by = ‘cellTypes’, shape = ‘batch’)

结语

scMerge2能够对大量单细胞数据进行综合分析。随着公共多样本多条件单细胞研究的可用性持续激增，scMerge2 证明了其整合超过 500 万个细胞以进行进一步下游分析的能力，从而实现有效的下游荟萃分析。scMerge2在所有主要细胞类型的预测准确率方面有了显着的提高。最后，scMerge2能够结合从各种单细胞技术（如CITE-seq，CyTOF和图像质谱细胞术）获得的数百万个细胞的数据。

好了，小果带着大家已经学习了80%的知识了，剩下的内容就交给小伙伴们了！最后，大家如果对单细胞数据分析还不熟悉，又想尝试一下处理自己的数据，不妨试一下小果开发的生信云平台哦，一键出图，一键导出CNS级别的Figture！！赶快去试试吧！！点击 http://www.biocloudservice.com/home.html。

参考文献

1. scMerge: scMerge leverages factor analysis, stable expression, and pseudoreplication to merge multiple single-cell RNA-seq datasets. Yingxin Lin, Shila Ghazanfar, Kevin Y.X. Wang, Johann A. Gagnon-Bartsch, Kitty K. Lo, Xianbin Su, Ze-Guang Han, John T. Ormerod, Terence P. Speed, Pengyi Yang, Jean Y. H. Yang. (2019). Our manuscript published at PNAS can be found here.
2. scMerge2: Atlas-scale single-cell multi-sample multi-condition data integration using scMerge2. Yingxin Lin, Yue Cao, Elijah Willie, Ellis Patrick, Jean Y.H. Yang. (2023). Our manuscript published in Nature Communications can be found here.