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该研究者以肝细胞癌（LIHC）患者作为研究对象，旨在探索与炎症密切相关的预后特征，并利用生物信息学技术和LIHC基因表达大数据，构建更精确的预后模型，进而为LIHC患者治疗提供新的参考。
- 本研究结合了多个权威数据库，保证的充分的样本信息，也更直观明确的探索出与炎症密切相关的预后特征；
- 二是作者经采用单变量Cox回归分析、LASSO回归、10倍交叉验证及多变量Cox回归模型等机器学习方法对预后特征进行进一步的训练和检验，最后构建相关模型；
- 最后，作者分析了预后风险与免疫浸润、肿瘤微环境、免疫细胞和免疫治疗之间的相关性和差异。对机器学习感兴趣并且想要发表高分SCI的小伙伴们也可以借鉴一下本文的研究思路哦~（ps：机器学习再联合癌症研究无疑是发文利器，但常规套路想要发个好文章可谓痴人说梦，那对机器学习感兴趣但不知道怎么创新的小伙伴可以来找小云哦！这里有高分易复现的创新思路，小伙伴们赶紧来公众号后台找我噢！）
研究背景
肝细胞癌（LIHC）是危害最大的肿瘤之一，在未来几年内，每年的病例数将突破100万例，因此，改善进展和预后不仅是一个现实的问题，也是一个势在必行的问题。越来越多的证据表明，与传统的化疗或放疗相比，靶向治疗是治疗癌症的有效策略，寻找合理的靶点有助于药物的开发和临床的药物选择与组合。炎症是一种重要的生理和免疫反应，相关学者报道肿瘤的发展与炎症过程之间存在着复杂的串扰，一方面促炎因子和细胞因子能够增强机体的抗肿瘤作用，但另一方面阻断炎症信号通路反而可以提高癌症治疗效果。因此，在这项研究中，作者旨在探索与炎症密切相关的预后特征，并利用生物信息学技术和LIHC基因表达大数据，构建更精确的预后模型，进而为LIHC患者治疗提供新的参考。
数据来源
| 数据库 | 详细信息 |
| TCGA、GTEx、HPA及GEO数据库 | LIHC的RNA测序表达谱、IHC及单细胞数据 |
研究思路
首先，作者从TCGA和GTEx数据门户网站下载LIHC的RNA测序表达谱、突变数据和相应的临床信息，而LIHC的免疫组化（IHC）染色图像来自Human Protein Atlas（HPA）Visualization数据库，单细胞转录组分析来自GEO数据库中的GSE156337。作者先是观察了肿瘤与邻近正常组织中10个关键炎症相关基因的基因表达水平并统计了其拷贝数变异（CNV）的频率及其在染色体上的位置。为了研究上述炎症相关基因是否与LIHC的预后相关，作者根据这些基因的表达水平和通过内部一致性和聚类效应分析，将LIHC病例分成两个主要聚类，分别进行了生存分析、基因集变异分析及基因集富集分析显示。接着，作者将除正常组外的LIHC按1:1的比例随机分为训练集和验证集，对训练集进行单变量Cox回归分析，筛选与预后特征因素相关的信息，将其应用于LASSO回归并进行10倍交叉验证；在多变量Cox回归模型对预后特征进行进一步的训练和检验，最后筛选3个基因和2个lncRNAs进行预后风险评估，在此基础上，作者构建了预后风险评估模型即Inf-PR模型。随后作者分析了预后风险与免疫浸润、肿瘤微环境、免疫细胞和免疫治疗之间的相关性和差异。
主要结果
首先，作者从TCGA和GTEx数据门户网站下载LIHC的RNA测序表达谱、突变数据和相应的临床信息，而LIHC的免疫组化（IHC）染色图像来自Human Protein Atlas（HPA）Visualization数据库，单细胞转录组分析来自GEO数据库中的GSE156337。作者观察了肿瘤与邻近正常组织中10个关键炎症相关基因的基因表达水平，对比分析发现其中8个基因的表达水平有显著差异（图1A），其中，EIF2AK2、GSDMD、IL18、CASP1、PYCARD、NLRP3和NLRC4在肿瘤组织中的表达水平显著高于正常组织，而NLRP1的表达水平则显著低于正常组织；同时，作者从HPA数据库中进行免疫组化分析（图1B）和单细胞测序分析（图1C和D），同样证实了上述8个基因的表达水平在肿瘤组织和正常组织中存在差异，但在两组中上述基因均没有明显的遗传改变富集区，翻译后修饰的类型和位点主要为磷酸化修饰（图2A）。NLRP3具有最高的肿瘤突变负荷发生率（TMB），其错义突变的频率约为2%（图2B）；此外，作者统计了拷贝数变异（CNV）的频率及其在染色体上的位置，结果显示10个基因均保持一定的CNV频率，其中6个基因出现扩增，另外4个基因出现缺失（图2C）。
图1 LIHC中相关基因的突变状态及翻译后修饰
为了研究上述炎症相关基因是否与LIHC的预后相关，作者根据这些基因的表达水平和通过内部一致性和聚类效应分析，将LIHC病例分成两个主要聚类（图3A）。生存分析显示，炎症本身与疾病的预后没有直接关系（图3B）；接着，作者对两个簇之间的KEGG通路进行了基因集变异分析。结果显示，A集群主要富集于代谢途径如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解；而B集群主要激活疾病相关途径（图3C）；基因集富集分析显示，免疫细胞的丰度如活化CD4+ T细胞、活化CD8+ T细胞、活化树突状细胞和CD56dim NK细胞在集群B中比在集群A中具有统计学意义，但嗜酸性粒细胞相反（图3D）。综上所述，炎症并不能直接反映LIHC的预后，但它与信号通路的变异和免疫状态明显相关。
接着，作者将除正常组外的LIHC按1:1的比例随机分为训练集和验证集，对训练集进行单变量Cox回归分析，筛选与预后特征因素相关的信息，将其应用于LASSO回归并进行10倍交叉验证。结果表明，当LASSO模型中基因数为9时，比例风险模型曲线偏差最小（图4A）；在多变量Cox回归模型对预后特征进行进一步的训练和检验，最后筛选3个基因（SOCS2、SRXN1和TMEM25）和2个lncRNAs（AC015908.3和AC009403.1）进行预后风险评估，并根据风险评分将整个数据集中的患者分为高危组和低危组。其中生存曲线在高危组和低危组之间有显著差异，其中低风险评分的患者获得了更长的生存时间。在此基础上，作者构建了预后风险评估模型即Inf-PR模型。根据Inf-PR产生的大样本得分的中位数，阈值设为0.995，分数超过阈值即判定为高风险。为了评价模型的性能，作者将模型与传统临床指标进行对比分析，ROC结果显示上述预后模型（AUC=0.832）高于传统的临床指标，尤其优于进展期指标（AUC=0.667）；此外，Inf-PR模型的AUC值明显高于先前报道的4个模型（图4D）。
为了揭示预后模型的潜在免疫景观特征，作者分析了预后风险与免疫浸润、肿瘤微环境、免疫细胞和免疫治疗之间的相关性和差异。CIBERSORT分析显示，预后风险与巨噬细胞M0 和中性粒细胞的丰度呈正相关，而与嗜酸性粒细胞、单核细胞、活化NK细胞和静息记忆CD4 T细胞的丰度呈负相关（图5A）；采用ESTIMATE算法对高、低危患者的肿瘤微环境（TMEs）进行评价，其中StromalScore差异有统计学意义（图5B）；此外，免疫功能热图显示，细胞免疫功能，包括免疫检查点、细胞溶解活性和APC共刺激等在低风险和高风险之间存在统计学差异（图5C）；应用TIDE算法分析LIHC免疫治疗的获益，其结果显示，免疫治疗对高危患者的效果明显优于对低危患者（图5D）；除了针对PD-1的抗体外，免疫检查点的变异分析还显示了一组针对高危人群的潜在治疗靶点（图5E）。以上结果证实该模型是评估LIHC患者预后风险和选择合理免疫治疗的有用工具。
五.根据LIHC的预后模型选择治疗药物
为了研究LIHC不同风险组的敏感药物，作者检测了6177个高低风险组差异表达基因（DEG），并通过加权基因共表达网络分析将其分为10个模块，其中灰色模块与预后风险和人类疾病具有明显的正相关性（图6A-B）；结合GDSC和CTRP的数据集，利用脊回归模型计算对灰色模块中这些基因的药物敏感性。结果显示，包括洛伐他汀和索拉非尼在内的10种FDA批准的小分子药物对高危人群的105个基因具有更高的敏感性和微扰性；同时它显示了其他15种药物，包括阿霉素和乐伐替尼对低风险组的687个基因有更好的敏感性和扰动性（图6C-D）。此外，作者注意到大多数信号通路在高危组和低危组之间是相同的，但药物的敏感基因是不同的。因此，根据预后风险对患者进行药物选择是必要的。
文章小结
文章作者以LIHC患者作为研究对象，通过整合多组学和采用机器学习方法构建了LIHC炎症相关预后模型，为进一步给LIHC患者提供精细化治疗提供了可靠的理论依据。文章架构完整，多组学再加多算法，并且最后还进行了药物敏感性分析，绝对让审稿人青睐。小伙伴们对机器学习感兴趣的话，这篇文章无疑是一个很好的借鉴，宝子们可要好好抓住这样的机会哦。有进一步需要的小伙伴也可以扫码来找小云哟，我们能在生信分析和方案设计提供更完善的角度。
