围绕一个单基因，到底还能玩出什么花？
小云和大家分享过多个单基因的思路，如对单基因分析感兴趣的话，可以看一下我们前期三篇文章：
“单基因分析可做哪些内容？以8+文章为例，将10个研究步骤全部汇总，免疫浸润、单细胞等热点一网打尽，快来抄作业！”
“干货来袭！生信底牌— —单基因生信分析思路模板，墙裂推荐，生信小白闭眼入！！！”
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看了前面各种单基因分析的盘点后，今天小云再推荐一个分析方式—利用多组学，从多维度来论述同一个基因，讲究的是“螺蛳壳里做道场”，麻雀虽小五脏俱全。
比如，围绕着一个基因，从转录、蛋白、突变、表观和单细胞组等层面开展论述，将分析做到极致，玩出花来。
接下来，小云就以这篇8+的研究TTK基因与子宫内膜癌的干湿结合文章为案例，进行分析展示，方便大家复现。（如果没有分析思路或者文献复现有困难，可以找小云，超多创新性高的分析思路和分析服务供你选择！）
- 题目：综合多组学分析和功能验证表明TTK是一种新型的子宫内膜癌 EMT 激活剂
- 杂志：Journal of Translational Medicine
- 影响因子：IF=8.4
- 发表时间：2023年2月
研究背景
癌-睾丸抗原(CTA)通常在肿瘤和睾丸组织中表达，在其他正常组织中不表达。然而，目前没有全面研究与子宫内膜癌(EC)发展相关的CTA基因的表达和临床意义，并且EC中CTA基因TTK蛋白激酶(TTK)的临床相关性、生物学作用和分子机制也尚未完全了解。本文目的在于探索TTK基因在子宫内膜癌中的相关作用以及机制探索。
公共数据来源
| 数据集/队列 | 数据库 | 数据类型 | 样本信息 |
| LUAD-EC | TCGA | 基因表达数据 | EC患者基因表达
及临床预后数据 |
| GSE17025 | GEO | 芯片数据 | EC患者的癌与癌旁表达数据 |
| Human
Protein Atlas（HPA） |
HPA | 蛋白表达数据 | EC患者蛋白表达数据 |
| LUAD-EC | TCGA | 450K methylation芯片数据 | EC患者基因甲基化修饰数据 |
| GSE173682 | GEO | 单细胞测序数据 | 5个对EC患者的单细胞测序数据 |
研究思路
对EC的TCGA基因表达数据和GEO芯片数据为对象，采用Limma包筛选出差异基因，并对差异基因进行WGCNA分析构建共表达网络；通过使用特定基因模块的中值表达，将来自TCGA的EC样本分为两组：高表达和低表达组，利用KM生存曲线比较两个组别之间的生存差异，发现了3个与预后相关的表达差异显着的癌-睾丸抗原(CTA)基因；使用ROC分析来验证CTA基因中的TTK蛋白激酶(TTK)的临床诊断价值；进一步评估TTK基因的蛋白表达、基因突变、拷贝数变异和甲基化修饰差异等信息；在单细胞水平分析TTK基因的细胞定位；最后在细胞系中进行TTK基因的验证和功能试验。
主要结果
1. 针对EC患者表达谱数据的CTA相关基因筛选
将从CTDatabase检索到的255个CTA相关基因，在TCGA数据库的EC组织与正常子宫内膜组织中的表达水平进行比较，发现80个CTA基因上调，17个基因下调（图1A）。对80个上调的CTA基因进行ssGSEA分析，并根据富集分数将EC样本分成高CTA评分（CTA高）组和低CTA评分（CTA低）组（图1B）。差异基因分析显示，80个CTA基因中有45个在CTA高组中显着高表达（图1D）。对45个上调基因进行了单变量cox回归，发现其中三个（TTK、LY6K和NOL4）导致了不良结果（图1F）。经GSE17025数据集验证发现，TTK在I期EC组织中显着更高（图1G）。生存分析表明，高TTK表达与EC患者较短的总生存期显着相关（图1H）。TTK表达还可用于区分早期EC组织与正常组织，对早期EC诊断的AUC为0.873（图1I）。以上数据显示TTK在EC中上调，可能成为EC诊断和预后预测的潜在生物标志物。（ps：火山图也可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据一键出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。
图1针对EC患者表达谱数据的CTA相关基因筛选
2. TTK表达水平升高与EC表型相关
利用TIMER1.0数据库对TTK的表达水平进行泛癌分析。与正常样本相比，TCGA中几乎所有肿瘤类型中TTK的mRNA表达显着更高（图2A）。进一步在人类蛋白质图谱(HPA)数据库中也证明EC组织中的TTK水平远高于邻近的正常组织（图2E）。使用qRT-PCR和WB实验均证明TTK在EC细胞系中的表达量更高（图2G，H）。
图2 TTK表达水平升高与EC表型相关
3. 对EC中TTK基因的突变和表观遗传分析
根据TCGA中EC的体细胞突变数据，比较了TTK高表达组和TTK低表达组的突变情况（图4A）。Fisher检验的结果表明两组的突变谱存在显着差异（图4C），同时TP53突变在TTK高组中显着富集，突变频率高达53%（图4D）。并且，作者发现TTK高组中扩增和缺失的拷贝数变异(CNV)数量明显高于TTK低组（图4F）。
图4 对EC中TTK基因的突变分析
为了探索与TTK失调相关的表观遗传改变，作者进行了EC患者和对照组间的全基因组甲基化比较分析，发现位于启动子区域的59个GpG位点被差异甲基化（图5A、B)。对两组间差异基因的关联分析显示7个基因存在差异表达，其中两个基因（ANG和C4BPB）表现出高甲基化和下调，五个基因（BRINP1、KLHL1、NOL4、SLC6A15和PKIA)显示低甲基化和上调。甲基化和基因表达的相关性分析表明，这七个基因的基因表达受位于启动子区域的CpG位点的甲基化调节（图5C、D）。生存分析表明，两个高甲基化和下调基因的低表达与EC患者较短的总生存期相关（图5E、F）。
图5 对EC中TTK基因的表观分析
5. 与TTK差异表达相关的细胞亚群分析
作者分析了GEO数据库中包含5个EC样本的单细胞转录组数据集，共鉴定出10个细胞亚群（图6A、B）。作者以内皮细胞作为参照，分析上皮细胞、纤毛细胞和增殖细胞的CNV水平（图6C）。结果表明，三种类型的上皮细胞在1号染色体长臂均有扩增，与TCGA中的EC样本一致。同时作者发现CDCA8、FAM83D、RACGAP1和TTK等基因主要在增殖细胞中表达（图6D），表明增殖细胞亚群可能与肿瘤恶性增殖和转移有关。
图6与TTK差异表达相关的细胞亚群分析
6. 抑制TTK基因可降低EC细胞的EMT
为了验证TTK基因的功能，作者将HEC-1细胞的TKK基因敲低，发现细胞的增殖和侵袭水平降低（图7A-C），并且，TTK敲低显着增加了HEC-1细胞对TX的敏感性（图7D）。将TTK过表达时，Ishikawa细胞的增殖、侵袭和对TX的抗性持续增强（图7A-D）。除了细胞表型外，TTK还影响EMT过程（图7E）。经过LinkedOmics数据库评估发现，TTK的表达与CK-18、BMI-1和EZH2水平相关（图7F）。
图7 抑制TTK基因可降低EC细胞的EMT
文章小结
这篇文章对 “单基因分析”进行了新的拓展，围绕一个基因，进行了多组学、多维度的分析。限于篇幅，一些结果和图片未能展示完全，需要完整内容的粉丝，可以在原文中获取。单基因分析的可用场景是非常多的，可以侧重临床应用的模型构建，或者是基础研究方向的，比如拓展待测基因的各种可能的延伸信息，既可以充实背景，也可以扩充数据，进行找补，用来讲述一个更加完整的故事。不论是项目开题（硕士、博士），还是国自然前期基础延伸，或者是功能基因的功能试验，都具有重要作用。
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小云有话说
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