小云在PubMed的花园里挖呀挖呀挖~
挖到了好思路分享给大家~
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这回挖到的是个多热点联合的思路，创新性和数据量齐备，绝对满足高质量生信文章的要求，创新性主要体现在两点：
- 思路上创新：5种细胞死亡形式+热应激+ m6A的多热点串联，首先从选题上就赢了普通思路一大截
- 验证实验：生信+验证实验，走干湿结合的路子，这是生信发展的大趋势，也可以堵住某些不接受纯生信期刊的嘴
两条腿走路总比一条腿蹦的快，所以这篇文章投稿1个月就接收了，这种高质量、能快速发文的思路是不是超级适合需要毕业发文的你或者评职称需要文章的你呢？文中附带5种RCD基因+热应激基因集，换个癌种就能复现啦，心动不如行动哦！
- 题目：铜死亡相关基因PDHX和热应激相关基因HSPD1是食管癌中与细胞干细胞、异常代谢和免疫抑制相关的潜在关键驱动因子
- 杂志：International Immunopharmacology
- 影响因子：IF=5.714
- 发表时间：2023年3月
研究背景
热应激是食管癌(ESCA)发生和发展的基础。热应激损伤上皮结构，导致食管细胞异常的“细胞死亡-修复”模式，从而驱动肿瘤的发生和发展。然而，由于调节性细胞死亡(RCD)模式的独特功能和串扰，ESCA恶性肿瘤中的具体细胞死亡仍不清楚。
数据来源
| 数据集/队列 | 数据库 | 数据类型 | 样本信息 |
| TCGA-ESCA | UCSC Xena+ GDC | RNA-seq数据+SNVs/CNVs数据+甲基化数据+临床信息 | ESCA患者和正常对照 |
| GSE53625 | GEO | RNA 芯片数据+临床信息 | 119例ESCC患者肿瘤和配对正常组织 |
| GSE154148、GSE68990、GSE153637 | GEO | RNA-seq数据 | RBMX敲除细胞 |
| RCD相关基因 | 包含凋亡、细胞焦亡、坏死性凋亡、铁死亡和铜死亡共125个基因 | ||
| 热应激相关基因 | 25个基因 | ||
研究流程
首先利用TCGA-ESCA队列比较正常食管和ESCA组织中热应激和调节性细胞死亡模式基因(HRCDs)的mRNA表达，以探索与热应激和细胞死亡相关的失调模式。单变量cox回归分析筛选与OS显著相关的基因，Lasso回归分析构建基于6个HRCD相关基因的风险模型，并进行模型评估和验证。通过检测6个基因之间的遗传相关性，确定了促进ESCA进展的关键基因PDHX和HSPD1，筛选调节HSPD1或PDHX基因表达的RNA甲基化修饰基因RBMX，在RBMX敲除细胞数据集中分析HSPD1或PDHX基因与RBMX的相关性。分析PDHX和HSPD1与免疫浸润的相关性以及功能富集情况，并在细胞样本中验证其表达和功能。
主要结果
1. ESCA中热应激和细胞死亡相关基因表达分析
在TCGA-ESCA队列比较正常食管和ESCA组织中热应激和调节性细胞死亡模式基因(HRCDs)的mRNA表达，以探索与热应激和细胞死亡相关的失调模式（图1A）。通过GSVA分析热应激、泛凋亡、铜死亡和铁死亡在不同的ESCA阶段的富集分数变化趋势（图1E），发现从第一阶段到第四阶段，铜死亡评分保持升高，表明在ESCA铜下垂的潜在促肿瘤作用。（ps：GSVA分析也可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据一键出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。
图1 ESCA中热应激和细胞死亡相关基因表达分析
2. HRCDs相关风险模型的建立和评估
通过单变量cox回归分析筛选与OS显著相关的基因（图2A），再利用Lasso回归分析筛选得到6个与不良预后显著相关的HRCD基因，并构建风险模型（图2B, C）。基于风险评分的最佳临界值将患者分为高、低评分组，进行KM生存分析并利用ROC曲线评估预测性能（图2E, F），在GSE54625验证集中进行模型验证（图2I, J）。（ps：单因素/多因素Cox回归、LASSO回归分析、KM曲线、ROC曲线绘制都可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现哦，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。
图2 风险模型的建立和验证
3. 关键基因筛选及其与干性、m6A相关性分析
通过检测6个基因之间的遗传相关性，确定了促进ESCA进展的关键基因PDHX和HSPD1具有最强相关性（图3A），在HPA数据库中验证其蛋白表达（图3B）。通过Spearmań分析其与干细胞指数（miRNAs）的相关性（图3C，D）。通过相关性分析筛选可能调节HSPD1或PDHX基因表达的RNA甲基化修饰基因，发现m6A相关基因RBMX与HSPD1和PDHX显示出最大的相关性（图3H）。进一步分析ESCA中RBMX的表达（图3I），及其与生存预后的相关性（图3J, K）。最后利用RBMX沉默细胞系的数据集分析对照和si-RBMX细胞之间PDHX或HSPD1的表达差异以评估其调控关系（图3L）。
图3 关键基因筛选及其与干性、m6A相关性分析
4. PDHX、HSPD1与免疫浸润的相关性分析和功能富集分析
利用quanTIseq算法评估了TCGA队列中个体免疫细胞分数，并分析免疫浸润和基因表达之间的Spearman相关性（图4A, B）。筛选HSPD1、PDHX高表达和低表达患者间的DEGs（图5A, B），并进行KEGG 和 GSEA分析（图5 C-F），发现HSPD1或者PDHX与异常的细胞代谢和功能性免疫反应有关。 
图4 PDHX、HSPD1与免疫浸润的相关性分析
图5 功能富集分析
首先利用qRT-PCR比较正常食管和ESCA细胞系中HSPD1和PDHX的差异表达（图6A）。沉默HSPD1和PDHX后，通过CCK8检测细胞活力（图6C），伤口愈合实验检测细胞迁移（图6E），结果显示HSPD1和PDHX沉默抑制TE-1细胞的增殖和迁移。
图6 HSPD1和PDHX的表达和功能验证
文章小结
这篇文章从RCD+热应激+m6A多热点整合切入分析，创新性较高，内容比较丰富，数据量较大，干湿结合快速产出高分文章。目前这种将多种细胞死亡整合，再与其他热点联合分析的生信文章还不多，也就是说让你去发挥的空间相当大哟，利用这篇文章搜集到的基因集合，换个癌种能复现，快行动起来吧！
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