以目标基因集出发的预后文章，仅仅以简单思路分析已经很难发文了，但要发高分也不是无计可施。这不得不请出单细胞和一系列多组学分析来帮忙。不论是正在寻找简单易上手的高分思路的朋友，还是投稿受阻想补充点分析内容的同学，这篇文章一顶要看下去哦！！
今天大选的文章将衰老与肝细胞癌（HCC）相结合，收集衰老相关基因（SRGs）进行综合分析，以揭示衰老在HCC中的作用。文章从四个数据库全面收集了SRG，通过无监督聚类方法，鉴定了3个具有不同生物学特征、突变谱和肿瘤微环境浸润的稳健衰老亚型。接着提取了衰老亚型的特征基因，结合bulk和单细胞数据揭示了HCC的衰老水平，并证实衰老与肿瘤干性之间的关联。利用药物敏感性来筛选不同衰老状态的潜在衰老药。开发了一种新方法，用于筛选新的衰老标志物。MAFG、PLIN3等4个基因通过体外模型进行测定和验证。文章大范围收集目标基因集，获取大量公共数据，结合bulk和单细胞数据展开分析，分析方法多种多样，内容充实饱满，又包含简单实验，干湿结合发到1区10分+！！还在寻找生信发文好思路的同学们还不赶紧码住了！！ps：想要了解最新的生信思路，来找小云就对了，这里有不仅有热点方向还有创新思路，想思路复现可以直接扫码咨询
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● 题目：衰老相关基因的整合分析确定了肝细胞癌中具有独特特征的稳健预后亚型
● 杂志：Journal of Advanced Research
● 影响因子：IF=10.7
● 发表时间：2024年4月
研究背景
衰老是指细胞生长永久停止的一种状态，被认为是一种肿瘤抑制机制，而越来越多的证据表明，衰老细胞在癌症进展过程中起着不利作用。由于缺乏反映癌症衰老水平的特异而可靠的标志物，这阻碍了我们对这一生物学基础的理解。
数据来源
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数据集/队列 |
数据库 |
数据类型 |
详细信息 |
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LIHC |
UCSC Xena |
表达矩阵和临床信息 |
424例肝癌样本 |
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GDC |
基因组突变数据 |
||
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LIRI |
ICGC |
mRNA表达谱和临床信息 |
377例肝癌样本 |
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GSE14520 |
GEO |
微阵列数据 |
42 个肿瘤样本和配对的非肿瘤样本 |
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GSE54236 |
GEO |
微阵列数据 |
161 个微阵列数据集 |
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GSE125449 |
GEO |
scRNA-seq数据 |
9 例肝细胞癌和 10 例肝内胆管癌患者 |
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GSE155182 |
GEO |
scRNA-seq数据 |
肝脏正常或诱发的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型 |
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IMvigor210 |
IMvigor210 |
RNA-seq数据 |
PD-L1治疗的尿路上皮癌数据 |
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GSE78220 |
GEO |
RNA-seq数据 |
PD-1治疗黑色素瘤数据 |
研究思路
收集SRGs进行综合分析，以揭示衰老在HCC中的作用。根据 SRGs 对 HCC 进行共识聚类。采用了多种计算方法，包括单样本基因组富集分析（ssGSEA）和模糊 c-means 算法。利用药物敏感性数据筛选出针对不同衰老患者的潜在治疗药物。此外，还开发了一种称为特征相关基因分析（SRGA）的方法，用于识别与相关表型相关的标记物。实验策略包括定量实时 PCR（qRT-PCR）、β-半乳糖苷酶测定、Western 印迹和肿瘤-T 细胞共培养系统，用于在体外验证研究结果。
主要结果
1. SRGs的转录组图谱定义了三个强大的HCC亚型
从AgingAtlas、HAGR、KEGG和Reactome数据库中全面检索了衰老基因集，这些数据库记录了调节细胞衰老、长寿或与衰老相关的基因。共保留了出现一次以上的 368 个基因作为最终的 SRG（图 1A ）。通过无监督聚类方法，利用SRGs可将LIHC患者分为三个亚型，即ClusterA、ClusterB和ClusterC（图1B）。进行了ssGSEA，以测量三个亚型中衰老通路的激活情况，结果表明ClusterC的富集程度明显更高（图 1C）。GLB1、TP53、CDKN1A (p21)、CDKN2A (p16)等广为接受的衰老标志物的表达量也从 ClusterA 增加到 ClusterC（图 1D）。生存分析表明，ClusterC 患者的预后最差，这表明 ClusterC 可能代表了一个高风险亚群（图 1E-H）。总之，这些结果表明，SRGs 对 HCC 患者具有很强的预测能力。
图1 根据 SRGs 确定三个稳健的 HCC 亚型及其特征
2. 衰老亚型的变异特征
考虑到基因组变异，对单核苷酸多态性（SNP）、小INDEL和拷贝数变异（CNV）进行了分析。列出了每个亚型的前10个高突变基因，其中TP53、RB1和CSMD1在ClusterC中的突变频率较高，而CTNNB1的突变频率较低（图2A-B）。在共现和互斥事件方面，ClusterA中TTN与AHNAK2、MUC16与RYR2、RYR3与USH2A之间存在显著的共突变。与其他两个亚型相比，ClusterB中的共现事件相对较多，CTNNB1与APOB、OBSCN与FLG、DNAH7与PCLO之间的共现事件显著。在ClusterC中，TP53与PCLO、RYR1与ADGRV1、ABCA13与PCLO之间存在显著的共突变（图2C）。利用 GISTIC2 检测了衰老亚型中的异常 CNV 区域。所有亚型都显示出 8q24 细胞带的扩增以及 1p36 和 8p23 细胞带的缺失。而在ClusterB中，6号染色体有特殊的扩增。而在 ClusterC 中，3 号染色体出现了独特的缺失（图 2D）。上述结果表明三个亚型存在不同的体细胞突变。
图2 三个衰老亚型的突变情况
3. 衰老亚型的免疫特征分析
肿瘤微环境（TME）是指恶性细胞与免疫细胞和基质细胞相互作用，共同促进或抑制肿瘤进展的场所。包括 CD274 (PD-L1)、PDCD1 (PD1)、CTLA4 等在内的多种免疫反应分子在 ClusterC 中的表达量显著升高（图 3A）。作者进一步利用ESTIMATE算法分析了三个衰老集亚型的整体TME状态。所有的免疫得分、基质得分和ESTIMATE得分在ClusterC中都是最高的，这表明免疫细胞和基质细胞的成分在ClusterC中更为丰富（图3B）。ssGSEA 对三个衰老亚型的免疫浸润进行了分析。T 细胞的比例在 ClusterC 中更高，而中性粒细胞的比例在 ClusterA 中更充足（图 3C）。作者分析了已发表的免疫肿瘤生物学研究（IOBR）中涉及免疫耗竭、免疫抑制和免疫排斥的特征，以探索免疫治疗潜力的多样性。表明免疫逃避或抑制的特征，如T细胞调节、髓源抑制细胞（MDSC）和癌相关成纤维细胞（CAFs），以及EMT、WNT和TGFb信号通路的激活，在ClusterC中最为富集（图3D-F）。
图3 三个衰老亚型的肿瘤免疫微环境
4. 聚类和提取衰老标记以量化衰老
根据SRGs在三个衰老亚型中的表达情况对其进行分组。在 LIHC 和 LIRI 数据集中发现了四个基因群。在这些基因簇中，LIHC 中的第 4 簇（n = 163）和 LIRI 中的第 2 簇（n = 146）因其有规律的表达变化而显示出区分三个衰老簇的巨大潜力（图 4A-B）。通过交叉两个基因簇之间的重叠基因，共提取了 100 个基因，并将其定义为 Sene.marker（图 4C）。在几个数据集中Sene.marker的平均表达量与衰老标记的表达量呈正相关（图 4D）。使用 GSEA 比较这些队列中 Sene.High 组和 Sene.Low 组的全局转录组表达，结果显示前者几乎富集了衰老通路的活性（图 4E）。总之，这些结果为剖析 HCC 中的衰老提供了证据。
图4 从三个亚型中识别衰老标记
5. 衰老与干性之间的联系
利用ssGSEA来测量每位患者干性相关特征的富集程度。结果显示，ClusterC或Sene.High组的干细胞相关特征活性最高（图5A-B）。还观察到衰老和干性标志物如EPCAM、KRT19、ANXA3、KLF4、CD44和PROM1的表达之间存在正相关（图5C）。治疗诱导衰老（TIS）通常出现在接受抗癌药物治疗的肿瘤细胞中，这反过来又会延长它们的生存期并最终导致复发。之前的研究报道了多种类型的肿瘤细胞在多柔比星干预后以 p53/p21 依赖性的方式发生 TIS。在此，Huh7 细胞经多柔比星处理 4 天后，在不含多柔比星的培养基中培养，每 2 天更换一次培养基，直至 15 天，生成体外 HCC 衰老模型（图 5D）。在多柔比星处理后，Huh7细胞表现出衰老，SA-β-gal染色显示了这一点（图 5E）。与其他亚型相比，代表衰老状态的ClusterC中干性标记物的表达更高（图5F）。在TIS模型中也观察到了一致的结果（图5G）。综上所述，这些发现证实药物治疗后干性重编程，并与衰老相关。
图5 HCC 衰老过程中的干性重编程
6. 预测Sene.marker的潜在衰老缓解和免疫疗法疗效
为了进一步了解衰老群的临床应用，评估了LIHC患者的药物敏感性与Sene.marker平均表达量之间的关联。共发现82种药物呈显著负相关，这些药物被认为是敏感药物，而只有3种药物呈正相关（图6A）。其中，观察到较多靶向有丝分裂、凋亡调控和 PI3K/MTOR 通路的药物，为开发管理肿瘤衰老的药物提供了新的思路（图 6B）。观察到化疗药物SB505124、AZD2014和Selumetinib对Sene.marker表现出耐药性，但可能是属于ClusterA的患者的合适治疗药物（图6C-E）。另一方面，药物Tozasertib、Osimertinib和UMI-77对Sene.marker最敏感，这表明它们有可能成为ClusterC的解毒剂（图6F-H）。这些结果为不同的衰老组提供了量身定制的治疗策略。还研究了 Sene.marker 预测免疫疗法患者反应的能力。在两个独立队列中，Sene.marker较高的患者总生存期延长（图 6I，L）。这可能是由于肿瘤衰老过程中表达的免疫检查点分子水平较高，以及免疫抑制细胞的富集（图 3）。这些特征与免疫治疗反应的增强相关，并确保患者从免疫系统的重新激活中获益。此外，在 IMvigor210 中，Sene.High 组患者的肿瘤突变负荷和新抗原负荷明显较高（图 6J-K），而新抗原编码的异常蛋白可被免疫细胞识别并消灭。因此，衰老评分较高的患者可以利用免疫疗法。
图6 Sene.marker 与药物敏感性和免疫疗法疗效之间的关系
7. SRGA 有助于鉴定新的衰老相关基因
为了鉴定与衰老相关特征相关的候选基因，作者开发了一个名为 SRGA 的 R 软件包（图 7A）。SRGA 整合并修改了 ImmLnc 和 GSEA 的框架，利用大量转录组数据和先验生物学知识来识别与免疫、衰老等感兴趣的表型相关的新标记，或可扩展到癌症转移和耐药性。同时，通过差异表达分析为每个衰老簇提取了标记基因，结果是ClusterA有22个基因，ClusterB有132个基因，ClusterC有2090个基因。通过使用来自 AgingAtlas 的 12 个通路以及预先定义的 Sene.marker 作为特征，并将总共 2244 个亚型标记作为输入，应用 SRGA，获得了与每个特征相关的基因。这些特征涉及 17 至 2009 个基因（图 7B）。此外，还构建了前 5 个特征基因对网络，其中 UBD、SPINK1、CENPU 和 HLA-DRA 分别与两个不同的特征显著相关（图 7C）。另外，作者还根据基因与衰老特征的计算得分对基因进行了排序（图 7D）。为了找出与预后相关的基因，团队将前 20 个基因纳入了 LIHC 和 LIRI 数据集的 Cox 和 Kaplan-Meier 模型。最后，MAFG、TUBA1C、CSTF2、PLIN3、FAM83D 和 MMP12 这六个基因被选为与患者生存相关的新衰老相关基因。
图7 鉴定新的衰老标记
8. 验证新的衰老标记
使用多柔比星处理了Huh7细胞，用不同浓度的多柔比星处理Huh7细胞4天，或用50 nM浓度的多柔比星处理不同时间，Huh7细胞都表现出明显的衰老，包括形态变大变扁（图8A），SA-β-Gal染色增强（图8B），p21和p53蛋白表达增加（图8C）。此外，当Huh7发生衰老时，MAFG和PLIN3的蛋白表达也升高（图8C）。同样，在剂量和时间依赖性模型中，新发现的衰老标记物的 mRNA 表达也增加了（图 8D-E）。这些数据表明，SRGA 在鉴定某些表型的新标记物方面是切实可行和可信的。
图8 多柔比星诱导衰老的 Huh7 细胞中新标记物的表达增加
9. MAFG调控HCC的衰老相关表型和MAFG 在衰老细胞中的免疫抑制作用
为了进一步探究衰老背后的潜在机制，重点研究了MAFG，因为它是一种转录因子，而且得分最高。在衰老模型中敲除 MAFG 可减轻多种衰老特性，导致衰老标志物在 mRNA 和蛋白水平的表达减少（图 9A-B），SA-β-Gal 染色减少（图 9C）。随后，对 MAFG 的作用进行了更深入的研究。最近的研究报告指出，MAFG能够与PD-L1的超增强区结合，从而调控其转录。事实上，当Huh7发生衰老时，PD-L1的表达会增加，而通过敲除MAFG可以缓解这种情况（图9D）。因此，MAFG可能在衰老诱导的干性和免疫重编程中发挥重要作用。
为了进一步证实 MAFG 的免疫调节作用，采用了活化 T 细胞和肿瘤细胞共培养系统（图 9E）。T 细胞参与了衰老细胞的监控和清除。敲除衰老细胞中的 MAFG 能显著增加 T 细胞的细胞毒性（图 9F）。还获得了基因工程小鼠肝脏内皮细胞的 scRNA-seq 数据。Mafg的表达也可以在tom-（非衰老）和tom+（衰老）细胞之间进行区分。根据 Mafg 的表达，这些衰老细胞被分为 Mafg 和 Mafg 两种。Cd274 转录本在 Mafg 衰老细胞中表达更频繁（图 9G）。GSEA显示，Mafg衰老细胞中平衡、表皮细胞发育和分化相关通路的激活增加，而Mafg衰老细胞则富集于抗原处理和递呈相关通路（图9H）。因此，Mafg衰老细胞更容易被免疫细胞识别和清除。
图9 敲除 MAFG 可减轻衰老相关表型并增加 T 细胞介导的细胞毒性
文章小结
该研究结果为 SRGs 在患者分层和精准医疗中的作用提供了见解。文章发现了具有不同生存结果、突变情况和免疫特征的三个强大的 HCC 患者预后亚型。进一步提取了衰老亚型的特征基因，从而构建了衰老评分系统，并以bulk和单细胞的数据分析了HCC的衰老水平。衰老诱导的干性重编程在实验得到了证实。高度衰老的HCC患者免疫功能低下，对托扎色替布和其他药物敏感。作者认为MAFG、PLIN3和其他4个基因与HCC衰老有关，MAFG可能介导免疫抑制、衰老和干性。文章分析层层递进，思路十分清晰，多组学数据相结合，采用了多种分析方法，逻辑非常严谨，干湿结合拿下1区10分+稳稳当当！！（ps：发文还缺好思路的同学们，别再犹豫啦，快来找小云唠唠，超多新颖的分析思路供你选择哦！）
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原文始发于微信公众号（云生信学生物信息学）：1区10分+预后文章有何乾坤？华西医院团队：衰老特征基因+多组学分析，经典思路解锁隐藏新玩法！！