不管是SCI文章还是国自然，乳酸化修饰一直是热点。在生信文章方面，虽然乳酸化修饰的文章这俩年是越发越多了，但是别担心！目前做乳酸化相关生信文章还是可以在第一梯队发文章！今天馆长要给大家分享一篇7+乳酸化+实验的预后文章~（ps：你们还想学哪种类型的生信分析，告诉小云 ~）
作者首先利用临床样本做湿实验研究了在结肠癌中乳酰化的存在。利用 AUCell算法，单细胞RNA测序数据中的相关性分析，以及在相关公共数据库进行证实并识别预后标志物。此外，作者还分析了乳酰化相关基因风险与临床特征、突变情况、生物学功能、免疫细胞浸润、免疫治疗反应和药物敏感性之间的相关性。本文的优势在于不仅仅生信分析丰富，而且还在临床样本中进行验证。多维角度打造了一篇预后文~里面的生信分析手段值得学习，心动不如行动起来吧！（ps：关注小云，我有很多生信热点和思路帮你快速上分 ~）
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题目：一个多维的方法阐明乳酸化相关的标志物的复杂性在结肠直肠癌的预后和治疗见解
杂志：Journal of Translational Medicine
发表时间：2024年2月
结直肠癌（CRC）是世界上最常见的诊断癌症之一，早期诊断和精确治疗可以显著提高患者生存率。此外，常用的结直肠癌治疗药物在化疗初期表现出疗效。乳酸化是翻译后修饰（PTMs）领域的新贡献者，结直肠癌细胞通常表现出代谢特征，包括乳酸积累，影响肿瘤的起始、发育和免疫环境。乳酰化在各种肿瘤中表现出失调。然而，它在结直肠癌中的复杂参与，特别是非组蛋白乳酰化及其与代谢和免疫逃避的交叉，仍然是个谜。
研究思路
利用组织微阵列上的免疫组织化学分析以及结直肠细胞系的临床信息和免疫荧光，研究整体乳酰化的存在及其与结直肠癌发生和进展的关系及其功能定位。利用AUCell算法以及单细胞RNA测序数据中的相关性分析，以及TCGA数据集中的Cox回归和Lasso回归分析并在GEO数据集中得到证实，确定了预测结直肠癌预后的基因特征。随后，分析乳酰化相关基因风险与临床特征、突变情况、生物学功能、免疫细胞浸润、免疫治疗反应和药物敏感性之间的相关性。
1.在结直肠癌中，整体乳酸化水平上调并与肿瘤进展相关
首先，对CRC样本进行了验证，发现与邻近的正常组织相比，癌变组织中的整体乳酸化水平升高（图1A）。与正常结肠上皮细胞系NCM46相比，CRC细胞系进一步证实了该观察结果（图1B）。此外，利用免疫荧光来评估CRC细胞系的综合乳酸化状态。结果表明，赖氨酸乳酸化并不集中在细胞核中，但也存在于细胞质中，在多种蛋白质修饰中的流行。对一个综合的组织芯片进行了免疫组化染色，CRC组织中全球乳化水平较正常组织大幅增加（图1C），并且乳化水平随着阶段的增加而上升（图1D）。此外，无论是在早期（I-III期）和晚期（II期）患者中，较高的整体乳酸化水平与不良预后相关（图1E，F）。通过单因素和多因素Cox回归分析，乳酸化水为结直肠癌的独立预后因素（图1G，H）。高乳酸化组表现出更高的复发率和远处转移率，以及更晚期的肿瘤分期（图1I-K）。这些研究结果强调了乳酸化作为结直肠癌预后标志物的潜在意义，阐明了其与疾病进展和预后的相关性。
图1 总体乳酸化水平在结直肠癌中上调，并与肿瘤进展相关
2.从单细胞转录组中鉴定结直肠癌中的乳酸化相关基因（LRGs）
对单细胞测序数据进行了深入分析，将所有细胞聚为22个不同的组，如图2A所示。11个特定细胞簇的分布如图2B所示。根据中位AUC评分，对所有细胞进行LRGs的AUC评分，并将其分为高乳化AUC组和低乳化AUC组（图2C）。具有大量乳酸相关基因（LRGs）的细胞主要是红色的免疫细胞，如NK细胞、T细胞和B细胞（图2D）。随后，在高乳酸化组和低乳酸化组之间鉴定了879个差异表达的基因（DEGs）。此外，相关分析显示了与乳化活性最密切相关的前100个高度乳化相关的基因（CORGs）（图2E）。通过基因集变异分析（GSVA）、基因本体（GO）分析进一步研究了LRGs相关的分子特征。乳酸化在“MYC”、“PI3K-AKT-mTOR”、“缺氧”等促肿瘤通路中发挥了至关重要的作用，并与免疫相关通路如“INTERFERON_GAMMA_RESPONSE”、“IL2_STAT5_SIGNALING”和“TGF_BETA_SIGNALING”相关（图2F-H）。
图2 与肿瘤进展相关从单细胞转录组中鉴定CRC中乳酸化相关基因(LRGs)
3.新型的LRG标志物揭示了对结直肠癌预后的预测能力
分析TCGA队列来提取LRG预后特征。首先，通过单变量Cox回归分析确定了67个与CRC相关的候选基因，如热图（图3A）所示。然后采用Lasso分析，鉴定了23个基因（图3B）。这些基因组成一个LRG评分的预测模型（LRGS）（图3C）。最初的11个基因与高风险相关，而随后的12个基因与低风险相关。该综合模型整合了这些个体基因的预测能力，以作为评估CRC预后的参考工具。
根据中位风险评分将患者分为高、低风险组，评估LRG特征的预后价值。Kaplan-Meier生存期分析显示，两组来自GSE39582和GSE17536的CRC患者的总生存期（OS）存在显著差异，此外，ROC分析显示1-、2-、3-、4-和5年对TCGA训练集、GSE39582测试集和GSE17536测试集具有较强的预测能力（图3D-F）。
图3 新型LRG特征揭示了对结直肠癌预后的强大预测能力
scRNA-seq数据分析显示，HSPB1、ACTG1、SFPQ、RBM3、LY6E、AP2M1、RAB5C、MED10、RBM17、METTL9、LGALS4主要在上皮细胞和内皮细胞中表达，而LEPROTL1、TERF2IP在T和NK细胞、ARL4C、ARPC1B、SLC2A3、H2AFY、LITAF在单核细胞巨噬细胞中表达突出（图4A）。此外，NR1H2、PTTG1在所有细胞簇中均检测水平较低。KEGG富集分析也表明，LRGs与吞噬小体、抗原加工和呈递等有关（图4B）。随后，大量RNA转录组进一步分析显示，LEPROTL1、SLC2A3、LY6E、ARL4C、AP2M1、RAB5C、LITAF与免疫评分呈正相关，而LLC2A3、LY6E整体与免疫细胞膨胀呈负相关， LITAF、ARL4C、SLC2A3和LEPROTL1与几乎所有免疫细胞显著相关。对不同细胞系中特征基因的表达水平进行了全面的评估。与正常细胞系相比，CRC细胞系中RBM17、TERF2IP、AP2M1、NR1H2、MED10、HSPA1B、ARL4C、LY6E、ARPC1B、HSPB1的RNA表达水平显著升高（图4C）。此外，为了加强这些基因表达改变在CRC中的重要性，进一步研究了它们在临床组织中的水平（图4D）。此外，研究扩展到核心风险基因的蛋白表达水平，包括AP2M1、LY6E、ARL4C、ARPC1B和TERF2IP，与RNA水平一致(图4E-I)。
图4 从单细胞转录组中鉴定CRC中乳酸化相关基因(LRGs)
深入研究了LRGS模型在TCGA队列中的基因组异质性。我们对LRG突变基因的突变景观进行了研究，并与频繁突变的基因如APC、TP53、TTN和KRAS进行了相关性分析（图5A, B），结果显示LRGs不携带实质性的突变负担，但与“RTK-RAS”、“WNT”、“Hippo”、“PI3K”、“MYC”和免疫相关通路如“TGF-β”等促肿瘤通路密切相关（图5C）。随后，进行了功能富集分析，高危组在血管生成”、“顶端连接”、“凝固”和“上皮间充质转化”中富集（图5D）。低风险组在“E2F靶点”、“MYC靶点”、“氧化磷酸化”、“G2M检查点”和“MTORC1信号通路”中表现出富集（图5E）。根据风险评分，GSVA分析显示122条通路存在双向表达。值得注意的是，高危组与“notch信号通路”、“WNT信号通路”、“ECM受体相互作用”、“局灶粘附”和“醚脂代谢”等通路呈正相关，均有助于肿瘤生长（图5F）。此外，我们对标志通路活动与LRG风险评分进行了相关性分析，揭示了高危组和低风险组之间的不同特征，进一步证实了高风险与上皮间充质转化、血管生成、缺氧、notch信号以及在IL2-STAT5信号、TGFβ信号、IL6 Jak stat信号、IFNγ信号等免疫信号中发挥重要作用（图5G）。
作者采用了7种不同的算法证明了在低风险肿瘤中T细胞膨胀的升高（图6A）。此外，通过CIBERSORTx对22个免疫细胞景观进行评估，发现T细胞亚型存在显著差异，CD4记忆细胞显示出较低的膨胀，而高LRG评分组的Treg和巨噬细胞表现出较高的膨胀（图6B）。此外，树突状细胞在低风险组中普遍存在。ssGSEA分析表明在低风险组中具有强大的抗肿瘤免疫应答（图6C）。高危人群组中PD-1和PDCD1等免疫检查点基因（ICCDs）的表达升高，提示了潜在的治疗靶点（图6D）。通过多重免疫组化（mIHC）验证了ARL4C、ARPC1B和TERF2IP在肿瘤组织中的显著性，它们的表达与CD8 T细胞的存在呈负相关（图6E，F）。
利用TIDE评分，高危组的排除评分、功能障碍评分和总体TIDE评分均有显著增加（图7A，B）。亚类定位（Submap）结果进一步表明，低风险组可能对PD-1治疗更敏感（图7C）。此外，在多个免疫治疗数据集验证了有效性，IMvigor数据集显示低风险组更好的生存结果（图7D）和对抗PD-1免疫治疗的反应（图7E）。低风险患者在I或II期（图7F）和III或II期（图7G）中均表现出较好的预后。在GSE78220数据集中也是一致的结果，低风险组对免疫治疗的具有良好反应（图7H，I）。
为了寻求LRG评分的其他临床适用性，作者进行了独立和多种预后分析，以确定影响结直肠癌预后的潜在因素，并认为LRGR是结直肠癌的独立危险因素（图8A，B）。观察模型基因与各种临床特征之间的相关性，观察到高危组中不良T期、N分期、M分期和临床分期值的患病率较高，而与年龄和性别没有显著相关性（图8C-F）。利用TCGA-CRC数据集，开发了一个预测列线图，该图将风险评分与关键的临床病理参数如T分期和N分期相结合，以预测1年、3年和5年的OS率（图8G）。校准曲线将列线图的准确性与1年、2年和3年预测的实际结果相一致（图8H）。DCA分析显示，在对患者的临床获益方面，列线图优于单独使用LRGS（图8I）。AUC曲线进一步证实了列线图与风险评分和其他常规临床检测相比具有优越的预测性能（图8J）。
图8 结合LRG评分和临床参数进行精确预测的列线图
为了确定高LRGS CRC患者的潜在治疗选择，采用了化学药物和靶向药物的综合分析。从CTRP数据集中，GANT-61、NSC23766和PRIMA-1成为潜在的候选基因（图9B），而PRISM数据集突出了罗米德蛋白酶、洛拉替尼、替二唑-磷酸盐等（图9C）。这些药物的AUC值在高LRGS组中明显较低，表明有更好的敏感性。此外，在低风险组中，顺铂、吉西他滨和紫杉醇的半抑制浓度值明显低于高风险组，提示对低风险患者有潜在的益处。相反，吉非替尼在高危组中的半抑制浓度较低，使其成为更适合该组的选择（图9D-G）。9个LRGS相关基因，包括ARPC1B、TERF2IP、ARL4C、UBE2I、LGALS4、SFPQ、HMGN2、LEPROTL1和H2AFY，与特异性化疗药物的敏感性相关（图9H）。
图9 结合LRG评分和临床参数进行精确预测的列线图
本项研究通过整合肿瘤组织芯片、TCGA数据集、GEO数据集的综合分析，结合计算机研究和体外实验，确定了一个能够预测结直肠癌患者预后的23个基因的乳酰化相关基因风险模型，在改善结直肠癌患者的管理和增强治疗效果方面表现出巨大的潜力，特别是在代谢和免疫逃避的交叉点上。这一发现强调了结直肠癌中整体乳酸化的临床相关性，并为结直肠癌中高乳酸浓度的机制研究和靶向治疗策略奠定了基础。看来预后模型还是很吃香呐，学会构建预后模型的手法，下一篇7分+高分文章就是你啦！你学会了吗~关注小云，热点+思路手把手教你！
原文始发于微信公众号（云生信学生物信息学）：“乳酸化修饰”如此简单？复旦大学附属肿瘤医院李大卫团队从多维角度建立肿瘤预后模型发7分+！
