今天给大家分享一篇聚焦肿瘤微环境的创新力满满的文章！文章转载自科研狮公众号，点击上方名片加关注~
这篇研究就像是使用高清微距镜深入肺腺癌微世界的探险。不仅发现了微环境中不同细胞的交流方式，还揭示了一个关键的角色：NOTCH3。NOTCH信号通路激活肺腺癌肿瘤相关间充质细胞，增加胶原生成，增强细胞侵袭能力，在肿瘤间质重塑中发挥重要作用。这篇文章还应用了一个技术“组织成像质谱流式”（Imaging Mass Cytometry）技术，这个技术突破了传统免疫荧光（IF）串色以及组织自发荧光的信号干扰的问题，将单张组织切片可以检测的参数个数提升至几十个，大幅增加了单个样本的数据量，有助于更加全面、高效地鉴定组织中的生物标志物，快来跟师哥一起看看吧：
1，单细胞分析揭示微环境重塑的机制：通过单细胞分析技术深入探索肺腺癌微环境中不同细胞类型之间的相互作用；
2，对NOTCH3在不同微环境下的影响进行深入研究：根据肺腺癌患者的基质水平将样本进行分组，进一步分析了NOTCH3在不同基质状态下的表达与患者预后的关联。这种分层分析提供了更细致的认识，发现高NOTCH3表达可能对肿瘤微环境的特定类型产生更为显著的影响，这是研究方法上的创新之处。
综合来看，这项研究在理解肿瘤间质生物学、NOTCH驱动的细胞间相互作用以及NOTCH3作为潜在间质靶点的临床相关性方面提供了超越先前scRNA-aeq研究的见解~(ps：缺乏新的方案思路？方案设计有困难？数据生信分析水平决定着测序结果质量，快来师哥这里多学习，我们这里的高级分析，可以帮助您提高分析广度和深度！随时联系小云，为您解决烦恼！)
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题目：单细胞分析确定NOTCH3介导的促进肺腺癌微环境重塑和侵袭的基质细胞之间的相互作用
肺腺癌（LUAD）是最常见的原发性肺癌类型。免疫检查点阻断（ICB）抑制PD-1等免疫抑制信号通路进而治疗晚期LUAD，然而大多数患者对此治疗不响应或会出现复发。使用患者来源样本的转录组学研究表明，基质或间质基因特征的富集与对ICB抵抗性密切相关，这表明间质细胞，包括癌相关成纤维细胞（CAF）在介导肿瘤基质中的免疫抑制和治疗抵抗方面发挥着至关重要的作用。在LUAD中，单细胞测序（scRNA-seq）已被利用来研究肿瘤微环境（TME）的异质性，细胞间相互作用及肿瘤侵润免疫细胞的免疫表型。
本研究使用scRNA-seq和成像质谱细胞测定法（IMC）解读间质异质性和空间定位。通过配体-受体分析对间质相互作用进行深入调查，揭示由内源性NOTCH配体驱动的肿瘤相关血管周细胞和CAF中NOTCH通路的激活。利用公开可用的患者测序数据，作者阐明了NOTCH3与多种ICB响应生物标志物结合的能力，以预测生存。
1.scRNA-seq数据分析确定了肺腺癌中间质细胞和其他主要细胞类型
作者对9名未接受治疗的患者（LUAD）进行scRNA-seq，其中6名患者有配对的癌旁组织（ANT），旨在分析肿瘤微环境中非免疫和免疫细胞的数量和类型（图1A）。经过质量控制和去除后，获得了256,379个总细胞和13,857个间质细胞。通过UMAP降维可视化，确定了八种不同的细胞类型（图1B-C）。
图1 scRNA-seq数据分析确定了肺腺癌中间质细胞和其他主要细胞类型
为了表征LUAD中间质细胞的异质性，作者对其进行亚群聚类，观察到四个明显亚群：FAP+PDPN+ CAFs、MCAM+ACTA2+周细胞、ACTA2+平滑肌细胞（SMC）和肺部驻留成纤维细胞（LRF）（图2A-B）。LRF主要来源于ANT组织，而SMCs由肿瘤和ANT的细胞组成（图2C）。FAP+PDPN+ CAFs和MCAM+周细胞几乎完全源自肿瘤。作者通过流式细胞术确认了这两个亚群的存在（图2D）。通过研究它们表达的其他标记基因，作者进一步确认了这四个亚群的注释（图2E）。
在肺腺癌中，CAFs和周细胞与间质/EMT/TGFβ标记基因集高度相关，而周细胞与血管生成标记基因相关性密切（图2F）。此外，myCAF标记基因在CAFs中最丰富，iCAF标记基因则在LRFs中富集（图2G）。
作者使用IMC技术（高维成像）在7个LUAD样本中标记了18种标志物，以研究细胞类型的空间排列对肿瘤基质的形成和维持的影响（图3A-B）。作者发现，MCAM+和ACTA2+细胞环绕CD31+血管的薄层，代表着血管周细胞或血管平滑肌细胞。而FAP+胶原I+CAFs则位于血管区和肿瘤实质之间的基质区域。为进一步分析和可视化，作者从7个样本种生成了细胞分割掩模和t-SNE图（图3C）。为了实现对细胞间相互作用的定量空间研究，作者使用了PhenoGraph技术，并在7个供体中鉴定了25个以特定表位为特征的聚类（图3D）。然后，作者进行了邻域分析，以研究肿瘤中细胞间的显著相互作用或避免（图3E），邻域分析揭示了肿瘤相关间充质细胞与内皮/T细胞之间的密切地形关联。
4. 配体受体分析发现肿瘤间质中NOTCH3信号失调
接下来作者鉴定血管和淋巴内皮细胞间相互作用，淋巴内皮细胞在UMAP中形成了一个独特的聚类，而血管内皮细胞则被重新分成了7个亚聚类，其中亚聚类N1、N2和N3在ANT样本中显著富集，而亚聚类T1、T2和T3在肿瘤中富集（图4A-C）。使用CellChat进行统计分析，与ANT相比，作者对肿瘤中信息流的统计测量值最高的11个信号通路进行优先排序（图4D），11条通路中的一些（如ESAM和SEMA6）主要由预测的内皮细胞或间充质细胞内的相互作用驱动（图4E），符合要求的前两条通路是MHC-II和NOTCH。
此外，通过对LUAD肿瘤间质中NOTCH信号通路的调查，作者发现多种内皮亚型促进了配体的表达，而NOTCH3是主要的受体，主要由周细胞和较低水平的癌相关纤维化细胞（CAFs）表达。进一步的验证显示，NOTCH3在供体中显著富集，且在LUAD肿瘤样本中显著上调（图4F-J）。
图4 配体受体分析发现肿瘤间质中NOTCH3信号失调
通过在肿瘤样本中扩增MCAM+NOTCH3+细胞并与原代人肺动脉内皮细胞共培养，并使用MRK003抑制NOTCH通路，作者发现MRK003处理显著降低了间充质细胞和内皮细胞共培养中的几个NOTCH靶基因的表达，包括COL1A1和CTGF（图5A-C）。进一步研究表明，MRK003处理还导致了COL1A1蛋白水平的显著降低 (图5D)。
接下来，作者发现通过抑制NOTCH通路，特别是使用MRK003等药物，可以有效减少肿瘤微环境中间充质细胞的侵袭性，从而抑制肿瘤细胞的转移和侵袭能力（图5E-I）。
6. NOTCH3在调节肿瘤间质和预测患者生存中的临床相关性
接下来作者评估了两个独立LUAD患者队列中NOTCH3表达与全基因表达的关联（图6A），COL1A1是与NOTCH3相关性最高的基因之一。作者进行通路富集分析（图6B），发现这些基因在细胞粘附、基质重塑、TGFβ诱导的成纤维细胞迁移和基质产生等通路中富集。
研究发现在LUAD患者中，尽管NOTCH配体JAG1、JAG2和DLL3与较差生存结果相关，但NOTCH3表达与之无关（图6C）。然而，在基质丰富的患者中，高NOTCH3表达与较差的预后标志相关，暗示高NOTCH3表达可能阻碍T细胞介导的抗肿瘤效应（图6D-G）。进一步分析表明，高NOTCH3表达与PD-1拮抗剂治疗耐药相关的基因签名存在显著正相关（图6H）。图6I说明间充质细胞和内皮细胞通过NOTCH通路在TME中的相互作用，这种相互作用激活间充质细胞，导致胶原沉积和细胞侵袭。
图6 NOTCH3在调节肿瘤间质和预测患者生存中的临床相关性
这项研究揭示了NOTCH3在肺腺癌微环境重塑中的关键作用，为我们深入理解肿瘤发展和治疗抵抗提供了新的视角。值得关注的是，高NOTCH3表达可能对免疫治疗的反应产生重要影响，这为未来个性化治疗策略的制定提供了重要线索。如果你也有一些想法却不知道如何开展实验，或者是想要量身定制实验方案，都可以来找小云，无论是生信分析还是基础实验，各种创新性思路设计，小云都可以帮你解忧哦~
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原文始发于微信公众号（云生信学生物信息学）：Cancer Research重磅来袭！单细胞测序+成像质谱测定：细胞间的隐秘互动大揭秘！
