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题目：TRIM29通过MEK/ERK通路促进吉西他滨的耐药性，并在PDAC中受到circRPS29/miR-770-5p轴的调节
杂志：Drug Resistance Updates
影响因子：IF=24.3
发表时间：2024年3月
研究背景
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种预后极差的恶性肿瘤，其发病率和死亡率高，对化疗药物如吉西他滨（GEM）的抵抗性是导致治疗失败和患者生存期缩短的主要原因。本研究旨在识别和理解与PDAC对GEM抵抗性相关的分子机制，以期发现有效的治疗靶点，提高治疗效果，延长患者生存期。
数据来源
GEO数据集：研究者利用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中的多个数据集（如GSE15471，GSE16515，GSE62452）来分析胰腺导管腺癌（PDAC）中TRIM29基因的表达差异。
TCGA数据库：使用了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中的临床信息和基因表达数据，以进行生存分析和相关性研究。
临床样本：研究包含了61对PDAC及相邻非癌组织样本，这些样本由南方医科大学珠江医院的肝胆胰外科研究所提供，用于蛋白表达水平的免疫组化（IHC）分析。
细胞系：使用了SW1990和PANC-1细胞系的吉西他滨耐药株（GR）用于体外实验。
动物模型：使用建立的裸鼠异种移植瘤模型来评估circRPS29对PDAC吉西他滨抵抗性的影响。
研究思路
本研究首先通过GEO和TCGA数据库分析了TRIM29在胰腺导管腺癌（PDAC）中的表达模式及其与患者预后的相关性。接着利用生物信息学工具预测了TRIM29可能的生物学功能及其与GEM抵抗性的关系，并筛选出可能调控TRIM29的circRNA和miRNA。之后通过体外细胞实验和体内动物模型验证了circRPS29/miR-770–5p/TRIM29轴在PDACGEM抵抗性中的作用，探讨了其通过MEK/ERK信号通路促进GEM抵抗性的分子机制，并评估了干预该轴对提高PDAC对GEM敏感性的潜在治疗策略。
主要结果
1.TRIM29过表达与PDAC患者预后不良相关
首先，通过分析GEO数据库中的三个独立数据集（GSE15471，GSE16515，GSE62452），研究者发现TRIM29在PDAC组织中的表达水平显著高于非肿瘤组织（图1A-C）。此外，利用TCGA数据库中的临床信息进行生存分析显示，高TRIM29表达与PDAC患者较差的预后密切相关（图1D）。为了进一步验证这些结果，研究者通过免疫组化分析在组织芯片（TMA）上评估了TRIM29蛋白的表达，结果同样表明TRIM29在PDAC组织中表达上调（图1E）。这些结果共同支持了TRIM29作为PDAC潜在生物标志物的可能性，并可能与其对GEM的抵抗性有关。
2.TRIM29与GEM抵抗性相关
通过比较PDAC细胞株SW1990和PANC-1及其对应的耐药株SW1990-GR和PANC-1-GR，研究者发现耐药株对GEM的敏感性显著降低，表现为GEM的半数抑制浓度（IC50）显著增加（图2E和F）。此外，通过siRNA技术敲低TRIM29的表达可以降低耐药株的IC50值，而TRIM29的过表达则增加了IC50值（图2G和H）。这些结果表明TRIM29的表达水平与PDAC细胞对GEM的抵抗性密切相关，提示TRIM29可能通过调节相关信号通路来影响PDAC的药物治疗反应。
3. TRIM29激活MEK/ERK信号通路
GSEA分析显示，TRIM29过表达与MEK/ERK信号通路的基因签名相关（图3A-D）。接着，蛋白免疫印迹分析发现TRIM29的过表达显著增加了MEK和ERK的磷酸化水平（即激活形式的pMEK和pERK），而TRIM29的敲低则降低了这些蛋白的磷酸化水平（图3E和F）。这一发现表明TRIM29可能通过调节MEK/ERK信号通路的活性来影响PDAC细胞的生物学行为。由于MEK/ERK信号通路在调控细胞增殖、存活和药物抵抗性中扮演着关键角色，TRIM29对这一通路的激活可能是其促进GEM抵抗性的分子机制之一。
4. circRPS29/miR-770–5p/TIM29轴的预测
通过生物信息学分析和实验验证，预测并探索了circRPS29、miR-770–5p和TRIM29之间的调控关系。研究者发现miR-770–5p在PDAC组织中表达下调，并且与TRIM29的表达水平呈负相关（图4A和B）。此外，临床数据表明miR-770–5p的低表达与PDAC患者较差的总体生存率相关（图4C）。通过ENCORI平台的分析，研究者预测了circRPS29可能通过与miR-770–5p相互作用来调控TRIM29的表达。后续的实验验证了circRPS29与miR-770–5p以及TRIM29 mRNA 3’UTR的结合位点，并通过荧光素酶报告基因分析、RNA免疫沉淀和circRNA pull-down实验进一步证实了这一调控轴的存在（图4D-G）。这些结果揭示了一个新的调控轴，可能在PDAC的GEM抵抗性中起着重要作用。
5. circRPS29/miR-770–5p/TRIM29-MEK/ERK信号轴的机制验证
荧光素酶报告基因分析证实了circRPS29和miR-770–5p以及miR-770–5p和TRIM29 mRNA 3’UTR之间的直接相互作用（图5A-D）。荧光原位杂交（FISH）和RNA免疫沉淀（RIP）实验显示了circRPS29和miR-770–5p在细胞质中的共定位，以及它们与AGO2蛋白形成的复合体（图5E和F）。此外，RNA pull-down实验进一步证实了circRPS29和miR-770–5p之间的直接相互作用（图5G）。蛋白免疫印迹分析揭示了circRPS29敲低或miR-770–5p过表达抑制了TRIM29、pMEK和pERK的表达，而miR-770–5p的抑制则逆转了这些效应（图5H和I）。这些结果共同证明了circRPS29通过miR-770–5p调控TRIM29的表达，并进而激活MEK/ERK信号通路，促进PDAC的GEM抵抗性。
6. TRIM29挽救circRPS29敲低对PDAC GEM抵抗性的抑制效应
克隆形成实验和EdU掺入实验显示，TRIM29的过表达可以逆转circRPS29敲低引起的细胞增殖和DNA合成的抑制（图6A和B）。细胞周期分析表明，TRIM29的过表达能够逆转circRPS29敲低诱导的细胞周期停滞（图6C）。Transwell侵袭实验进一步证实了TRIM29过表达能够增强PDAC耐药细胞的侵袭能力，而这种能力被circRPS29的敲低所抑制（图6D）。Western Blot分析揭示了TRIM29过表达能够逆转circRPS29敲低引起的TRIM29、pMEK和pERK表达的降低（图6E）。这些结果表明，TRIM29是circRPS29下游的效应分子，并且circRPS29通过TRIM29促进了PDAC的GEM抵抗性。
文章小结
本研究不仅指出了circRPS29/miR-770–5p/TRIM29-MEK/ERK信号轴在PDAC吉西他滨抵抗性中的重要性，而且为PDAC治疗提供了新的治疗靶点。对于追求高影响力研究成果的科研人员，本研究提供了一种清晰的研究模式，即从生物信息学分析到分子机制探索，再到临床意义的验证。对于那些希望探索未充分研究基因的科研工作者，本文的研究思路和方法具有很高的参考价值。看到这里，小云鼓励各位小伙伴扫码联系小云进行进一步的交流和探讨，以便在方案设计、评估和数据分析等方面获得更深入的指导和帮助~
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原文始发于微信公众号（云生信学生物信息学）：“干湿结合”发24分文章，性价比MAX！南方医科大学范应方等团队教你生信与实验无缝对接，展现科研无限可能！