温州医科大附属第二医院张维溪等团队1区7分+文章！铁死亡+多组学分析+干湿结合，非肿瘤疾病也同样给力！
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此篇文章中研究人员筛选了与哮喘患者铁死亡相关的潜在生物标志物。使用WGCNA分析了该基因在不同样本之间的基因关联模式。在机制上，探讨了其对气道上皮细胞中脂质过氧化和氧化还原反应的影响。为哮喘的诊断、治疗和分型提供了一种新的生物标志物，并确定了铁死亡的一个重要调控因子。
这个宝藏文章从公共数据库出发，结合实验验证，对疾病发生机制做出探索，内容充实，方法具体可行，值得大家伙来学习借鉴噢！！！继续往下深入学习吧~
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题目：生物信息学分析铁死亡相关基因AKR1C3作为哮喘潜在生物标志物及其在BEAS-2B细胞中的鉴定
杂志：Computers in Biology and Medicine
影响因子：IF=7.7
发表时间：2023年3月
研究背景
哮喘是一种气道壁的慢性复杂炎症性疾病，也是儿童时期最常见的慢性肺部疾病，影响全球超过3.5亿人。它是一种复杂的基因-环境相互作用，涉及形成其发病机制的多个信号通路。哮喘以支气管重塑和气道高反应性为特征;因此，哮喘的诊断和预后与气道上皮细胞损伤程度密切相关。气道上皮细胞被认为是哮喘炎症、免疫和再生过程的优先反应者。由于疾病的复杂性和异质性，患者在治疗过程中通常会遇到困难。根据患者在接受皮质类固醇治疗后是否仍有持续症状，通常将患者分为重度难治性哮喘(SA)或得到控制的持续性轻度哮喘(MA)。因此，迫切需要能够提高哮喘诊断和治疗效率的新型靶向方法。
数据来源
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数据集/队列 |
数据库 |
数据类型 |
详细信息 |
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GDS4896 |
GEO |
RNA-seq数据 |
54份样本 |
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GSE64913 |
GEO |
RNA-seq数据 |
– |
研究思路
本研究使用R软件对哮喘和铁死亡数据集进行了生物信息学分析，以确定候选铁死亡相关基因。采用加权基因共表达网络分析方法识别共表达基因。采用蛋白质-蛋白质相互作用网络、the Kyoto encyclopedia of genes and genomes和gene ontology enrichment analysis鉴定候选基因的潜在功能。使用小干扰rna和质粒在人支气管上皮细胞(BEAS-2B)中沉默和上调候选基因的表达来验证分析结果。检测铁死亡特征水平。对哮喘数据集GDS4896进行生物信息学分析显示，重度难治性哮喘和控制的持续性轻度哮喘(MA)患者外周血中醛酮还原酶家族1成员C3 (AKR1C3)基因水平显著上调。诊断哮喘和MA的AUC值分别为0.823和0.915。使用GSE64913数据集验证AKR1C3的诊断价值。AKR1C3基因模块在MA中很明显，并通过氧化还原反应和代谢过程发挥功能。过表达AKR1C3可下调铁死亡指标，沉默AKR1C3可上调铁死亡指标。铁死亡相关基因AKR1C3可作为哮喘尤其是MA的诊断生物标志物，调控BEAS-2B细胞的铁死亡。
主要结果
1.AKR1C3是唯一与铁死亡相关的DEG，也是哮喘预后的生物标志物
下载人类哮喘基因数据集GDS4896的原始文件，将探针替换为基因名称，得到同一基因的平均值。采用GDS4896基因集对SA和MA患儿的白细胞进行分析。GDS4896共纳入54份样本，包括18例健康者、19例MA患者和17例SA患者。以是否存在哮喘进行分类，KEGG通路分析显示，GDS4896的基因在多条通路中富集(P ＜0.05, FDR＜0.25)，包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路、Th17通路、脂肪酸代谢和铁死亡(图1a)。
同时，哮喘组和对照组之间有56个基因存在显著差异(logFC绝对值＞0.5和调整后的p值＜0.05)。对前期铁死亡数据库进行重复值组装和删除后得到包含259个驱动基因、抑制基因和标志基因的铁死亡相关基因集。维恩图显示，只有一个铁死亡相关基因AKR1C3在哮喘组和对照组之间存在差异表达。为了进一步检测AKR1C3的差异表达，我们使用铁死亡基因集构建了每两组差异基因的维恩图。我们的结果表明，AKR1C3在MA组和对照组之间以及SA组和MA组之间显示出显著差异(图1b)。与健康对照组相比，AKR1C3在哮喘患者中显著上调，且与哮喘严重程度无关。有趣的是，AKR1C3在MA组中的表达明显高于SA组(图1c)。
以AKR1C3表达水平作为预测因子，构建ROC曲线并计算AUC值。AKR1C3对哮喘具有良好的预测效能(AUC = 0.823;置信区间:0.713—0.932)。在哮喘组间，MA具有更高的诊断价值(AUC = 0.915;CI: 0.826 ~ 1.000)均高于SA (AUC = 0.719;CI: 0.546 ~ 0.892)(图1d)。采用GSE64913软件进行差异性比较和ROC曲线构建，对结果进行验证。该数据库用于分析外周气道上皮基因表达，包括SA组和对照组。AKR1C3在哮喘患者和对照组之间差异有统计学意义(AUC = 0.640;CI: 0.504-0.777)(图1e)。
图 1 AKR1C3在哮喘中的预后价值
2.通过WGCNA识别与AKR1C3相关的模块
为了获得AKR1C3的共表达基因，进一步使用R软件对GDS4896数据集进行WGCNA分析。在剔除5个异常值后，将10作为软阈值，达到邻接界值0.85(图2a)。随后将100设为最小的基因模块，构建聚类树图，从中识别出19个调控模块(图2b)。
模块与哮喘严重程度之间的关联如图2c所示。黑色和绿黄色模块表示与对照组的相关性最高(负值等于总哮喘)。此外，黑色模块对重度哮喘至关重要(cor = 0.61;P = 3 × 10 – 6)，而绿色-黄色模块对轻度哮喘很重要(cor = 0.5;P = 2 × 10−4)。基因集和哮喘表型在黑色和绿色-黄色模块中显著相关(cor = 0.51;P = 1.7 × 10−37,cor = 0.51;P = 2.1 × 10−20)(图2d)。此外，AKR1C3仅出现在绿色-黄色模块中，该模块包含从黑色模块分离出的287个基因(图2e)。其中，AKR1C3等11个基因在哮喘中存在差异表达。
使用STING数据库分析绿-黄模块中的基因，并使用Cytoscape可视化建立PPI网络。节点间线的粗细和颜色表示基因的综合得分。绿色-黄色模块中的12个蛋白与AKR1C3结合，如图2f所示。其中，AKR1C4和PTGDS与AKR1C3的相关性更强。
通过KEGG和GO分析确定AKR1C3所在基因模块的潜在通路。KEGG在代谢相关通路中显著富集，包括嘌呤代谢、代谢通路、脂肪酸降解、脂肪细胞中脂肪分解的调节和胆固醇代谢(图2g)。GO数据库的进一步分析显示，最主要的细胞成分是细胞质、内膜系统、囊泡和细胞外活性。在生物过程中，程序性细胞死亡以及脂质代谢和氧化还原过程与该模块有明确的关联。在分子功能上，该模块与酶表现出显著的相关性，如催化活性、酶调节活性、脂质结合、氧化还原酶活性以及代谢和氧化生物过程(图2h)
图2使用GDS4896数据集的AKR1C3的WGCNA
3.akr1c3的表达可保护BEAS-2B细胞免于铁死亡
在BEAS-2B细胞中，通过sirna沉默AKR1C3和质粒过表达AKR1C3，观察AKR1C3对铁死亡的影响。si-AKR1C3-1和si-AKR1C3-2在mRNA和蛋白水平均显示出良好的AKR1C3沉默效率。随机选取si-AKR1C3-1进行后续实验。结果显示，pcDNA3.1-AKR1C3显著上调BEAS-2B细胞中AKR1C3的表达(图3a)。
WGCNA结果表明，AKR1C3通过影响脂质代谢和酶相关的氧化还原反应在哮喘和铁死亡中发挥重要作用。Fe2+和脂质过氧化物在铁死亡中至关重要。将ferroOrange和Liperfluo探针共染BEAS-2B细胞后，通过共聚焦显微镜拍摄细胞照片。荧光图像显示，铁离子和脂质过氧化物都存在于细胞质的相似位置(图3b)。定量分析显示，与对照组相比，沉默akr1c3的细胞中Fe2+和脂质过氧化物的荧光水平显著升高，而过表达akr1c3的细胞中Fe2+和脂质过氧化物的荧光水平显著降低。这表明高AKR1C3表达水平能有效降低胞质内Fe2+和脂质过氧化物水平，从而提示过表达AKR1C3可抑制铁死亡。铁死亡诱导剂（erastin）显著增加BEAS-2B细胞中亚铁离子和脂质过氧化物的水平。同时，加入erastin后，过表达AKR1C3的细胞数量显著增加。然而，在AKR1C3低表达的细胞中，erastin并没有起到类似的作用，反而显著抑制了AKR1C3沉默引起的Fe2+和脂质过氧化物的增加(图3 – d)。
图 3 AKR1C3的表达可保护BEAS-2B
细胞免于铁死亡数据图
4.RARRES2改变MDAMB231细胞的脂质代谢
采用CCK-8法检测AKR1C3表达水平细胞的活性。数据显示，AKR1C3沉默的细胞活力显著降低，而过表达AKR1C3的细胞细胞活力增加，说明AKR1C3的表达可以显著影响细胞活力（图4a）。GSH参与了生物过程，如抗氧化剂和铁死亡，并被用作GPX4的底物。总GSH包括降低的GSH和GSSG，它们是相互转换的，GSH/GSSG比值通常被认为是氧化应激的重要指标。本篇文章研究结果显示，敲降AKR1C3可以显著下调GSH，而过表达AKR1C3可以上调GSH。此外，过表达AKR1C3并没有显著改变GSSG的含量，但敲降AKR1C3则会降低GSSG的含量。GSH/GSSG比值是代表氧化应激过程的重要铁死亡中间体，在AKR1C3的抑制下可显著降低，当过表达AKR1C3时，GSH/GSSG比值可上调（图4b）。此外，本篇文章还研究了过表达AKR1C3的表达是否显著降低了ROS的产生，以及AKR1C3的下调是否诱导了ROS的产生（图4c）。在铁死亡过程中，加入erastin显著下调AKR1C3（图4d）。我们通过qRT-PCR和蛋白印迹法检测了AKR1C3不同表达水平下的几个关键基因的表达水平。ACSL4促进铁死亡，而SLC7A11和GPX4对铁死亡有抑制作用。数据显示在基因和蛋白水平上，敲降AKR1C3增加了ACSL4，降低了SLC7A11的表达，而过表达AKR1C3则产生了相反的效果。这表明AKR1C3的高表达可能通过影响ACSL4和SLC7A11通路来保护细胞免受铁死亡的侵袭。AKR1C3的敲降和过表达都增加了关键因子GPX4的表达。进一步分析发现，AKR1C3过表达显著抑制了erastin 诱导的GPX4下调（图4e）。
图 4 AKR1C3对BEAS-2B细胞铁死亡的作用
文章小结
本文研究表明AKR1C3在哮喘，特别是MA中，具有很高的诊断和预后价值。通过实验验证，过表达AKR1C3可以保护BEAS-2B细胞免受铁死亡的侵袭。因此，AKR1C3可能是一种很有前途的预防哮喘铁死亡的生物标志物和药物靶点。
本篇文章数据在结合公共数据分析的基础上，还进行了基础实验探究其发生作用的具体机制，使文章内容更加充实，更具有临床研究与应用价值。近年来，铁死亡这一热点的研究仍然进行着，非肿瘤疾病的铁死亡方向研究也不断发展。如何让自己的文章更有新意是为文章增色的重要一环，多组学以及多热点的联合分析可以帮助大家拓展思路！快学起来叭！！！
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