2024-06-16

Nature communications！单细胞纯生信还有什么花样？瑞金医院联合bulk和CUT&Tag数据，0实验发16+！

馆长生信果 2024-04-16 19:01:07

转自公众号：生信图书馆
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单细胞分析还能怎么玩出花来？多组学相结合肯定是必不可少了！也可以从疾病角度多动动脑筋哦~~肿瘤领域的话，小众肿瘤或许更能助力发文！！

今天馆长选的文章利用scRNA-seq技术全面剖析了急性早幼粒细胞白血病（APL）的细胞异质性及其对体内全反式维甲酸（ATRA）治疗和早期死亡的潜在影响。作者从 16 名新确诊的 APL 患者的恶性 APL 原始细胞中生成了单细胞转录组资源。随后进行了细胞分群、细胞分化分析，以识别APL干样细胞。又采用靶向scRNA-seq在两名APL患者中验证了PML/RARα融合基因和FLT3-ITD的表达。通过去卷积分析，确定了细胞组成与临床表现之间的关联。接着探讨了ATRA治疗对患者在发病时和A治疗后细胞组成变化的影响。还成功构建了APL特异性干性评分，可有效评估预后。文章整合了自有队列数据和公共数据，样本量不小，数据量十分丰富，采用多组学分析，不仅结合了bulk数据，还增加了CUT&Tag数据共同分析，思路新颖，逻辑十分严谨，没有实验部分，也能妥妥投上Nature子刊！！还在寻找肿瘤发文好思路的朋友们赶紧收藏起来吧，高分文章等着你！（ps：想要了解最新的生信思路，来找馆长就对了，这里有不仅有热点方向还有创新思路，想思路复现可以直接扫码call馆长，等你哦！）

● 题目：细胞层次结构揭示急性早幼粒细胞白血病中的白血病干样细胞和早期死亡风险

● 杂志：nature communications

● 影响因子：IF=16.6

● 发表时间：2024年2月

研究背景

急性早幼粒细胞白血病（APL）是靶向分化治疗的典范，少数患者治疗失败甚至早期死亡。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	详细信息
HRA003777	NGDC	scRNA-seq数据	16个APL骨髓样本
GSE120221	GEO	scRNA-seq数据	20 名不同年龄段的健康成年人类供体的人骨髓细胞
GSE130116	GEO	scRNA-seq数据	B细胞急性淋巴细胞白血病患者样本和健康骨髓供体样本
GSE172057	GEO	scRNA-seq数据	348 名 APL 患者
GSE195776	GEO	CUT&Tag-seq数据	319 份 APL、393 份非 APL 急性髓系白血病和 700 份非肿瘤对照

研究思路

对采集自 16 名新确诊 APL 患者的骨髓（BM）样本进行了单细胞转录组分析。同时，重新分析了 23 个独立的健康人正常 BM 样本的 scRNA-seq 数据（GSE120221 和 GSE130116），构建了正常造血细胞群作为对照。基于本研究表征的 APL 病灶，首先构建了 APL 病灶的细胞结构和分化轨迹，重点是识别 APL 干样细胞。使用靶向 scRNA-seq (scTarget) 验证了两名新发 APL 患者中 PML/RARα 融合基因和 FLT3-ITD 的表达。通过对 323 例 APL 患者进行解卷积分析，确定了细胞组成与临床表现之间的关联。接着探讨了 ATRA 治疗对三名患者在发病时和 ATRA 治疗后第 2 天细胞组成变化的影响。又对 10 名新确诊的 APL 患者在 ATRA 治疗前后的 RNA-seq 数据进行了解卷积分析，以确定细胞组成（尤其是 APL 干样细胞）与体内 ATRA 反应之间的关联。

主要结果

1. APL 原始细胞的单细胞特征描述

首先将采集自 APL 患者和健康人的骨髓样本进行了比较分析。使用正常 BM 样本建立了细胞多样性基线，发现了七个主要细胞群。这些细胞群包括造血干细胞/祖细胞（HSPCs）、GMPs、单核细胞（Mono）、树突状细胞（DCs）、B 细胞、T/杀伤细胞（NK）和红细胞（Ery）。

接下来，利用 UMAP 将APL 患者的细胞以及正常造血细胞群投射到二维空间（图 1b）。APL 患者的淋巴细胞和红细胞形成的细胞群与正常造血细胞注释的细胞类型相对应，而 APL 细胞则主要归入一个独特的细胞群。使用 PML/RARα 靶向 scRNA-seq 技术在两个 APL 患者样本中观察到 PML/RARα 的单独表达，这证实了 APL 细胞群鉴定的准确性（图 1b）。该细胞群表现出 MPO 基因的高表达水平，MPO 基因编码了一种广泛使用的 APL 诊断标志物，而且也不同于正常的造血细胞群（如 HSPCs 和髓样细胞群；图 1b, c）。APL 细胞的既定标志物在该细胞群中高度表达，PML/RARα 相关超级增强子激活的基因（如 STAB1、CITED2、CCND2 和 GFI1）也突出显示了这一点（图 1d）。此外，该细胞群的 GMP 特异性基因，如嗜氮颗粒基因（MPO、AZU1、ELANE 和 CTSG）的表达水平明显升高（图 1d）。

接着比较了 APL 细胞群与正常 GMP 细胞群的功能和调控特征。首先，对使用 Seurat 计算的差异表达基因（DEGs）进行了GO富集分析。分析结果显示，APL胚胎中明显上调的基因与几个关键过程具有功能相关性，包括造血干细胞自我更新/分化、组蛋白修饰和 DNA 甲基化、细胞周期停滞和细胞生长，以及对内质网应激和未折叠蛋白的反应（图 1e）。与此相反，在 APL 细胞中明显下调的基因的基因富含免疫反应相关功能，包括抗原处理和呈递、MHC II 类蛋白复合物、细胞因子产生调控以及对干扰素-γ 的反应（图 1f）。这些发现证实了 APL 细胞的抗原递呈中断。其次，使用 VIPER 推断了两个细胞群之间不同的转录因子（TF）活性。分析表明，造血 TF 和辅助因子在 APL 细胞中受到抑制（图 1g），支持了在 APL 细胞中观察到的分化受阻。此外，干扰素（IFN）信号转导介质也在 APL 细胞中受到抑制。相反，与正常 GMPs 相比，致癌 TFs、表观遗传调节因子和细胞增殖相关 TFs在 APL 病灶中被激活（图 1g）。

图1 通过综合分析 APL 和正常骨髓 (BM) 细胞的 scRNA-seq 数据，确定 APL 原始细胞的特征

2. 表征APL原始细胞的瘤内异质性揭示了复杂的细胞状态转变轨迹，白血病干样细胞位于顶端

接下来，确定了APL原始细胞内的细胞结构和分化轨迹。通过无监督聚类和 UMAP 分析，确定了 18 个聚类，每个聚类都以已知标记基因的不同表达模式为特征（图 2a）。在这些聚类中，12 个 APL 亚群（C1-C12）占细胞总数的 82.9%，表现出 GMP 特异性基因的高表达，尤其是那些与嗜氮颗粒相关的基因（图 2b）。这些GMP样亚群显示出明显的异质性。例如，C1-C3 亚群只表达 GMP 特异性基因，而 C6-C10 亚群则高表达细胞增殖相关基因，C11-C12 亚群则高表达 S100 家族基因。

接下来，进行了RNA速度分析，以验证从白血病干样细胞群（C15）到GMP样细胞群的分化轨迹。根据基于速度的细胞状态转换概率和表达模式的相似性（图 2c、d），18 个 APL 亚群重组为六个分支，干样细胞亚群（C15）位于分化轨迹的根部。干样细胞亚群（C15）很可能经过Prog样分支（C14），产生了 APL 原始细胞的三个主要分支：GMP 样分支（C1-C5 和 C13）、循环 GMP 样分支（C6-C10）和 S100高表达GMP 样分支（C11 和 C12）（图 2c、d）。从 C15 开始的另一条轨迹通向 MDP 样细胞群（C16），随后分化成 CD1C+ PrecDC 样细胞群（C17）和 CD14+ 原单核细胞样亚群（C18）。这一轨迹支持了目前的观点，即 MDPs 可能代表了更早的阶段，甚至可能早于 CMP 阶段，而不是源自 GMPs。此外，Monocle2伪时间排序轨迹分析还显示，干样细胞群是APL原始细胞的起点，产生了S100高表达GMP样和GMP样分支（图2e）。该分析还显示，RUNX1、RUNX2和干扰素相关因子可能参与了GMP样分化轨迹，而CEBP家族成员、MAFB、JUNB和JUND可能与S100高表达GMP样APL原始细胞的系谱决定有关（图2f）。

此外，还研究了 PML/RARα 在已确定的 APL 轨迹中的作用。PML/RARα靶向scRNA-seq证实，PML/RARα在APL原始细胞的所有六个分支中均匀表达，在干样细胞集群中表达显著（图2g、h）。此外，整合了从 APL 患者衍生细胞系 NB4 的 CUT&Tag-seq中获得的 PML/RARα 染色质占位数据。每个分支都有相当多不同的 PML/RARα 靶点（图 2i），这表明在整个 APL 轨迹中，PML/RARα 靶点存在分支特异性表达模式。

图2 APL 原始细胞瘤内异质性的特征揭示了一个具有多个分支和少量 APL 干样细胞亚群的复杂轨迹

3. PML/RARα靶基因决定了APL干样细胞的特征，FLT3-ITD则进一步增强了其特征

为了深入研究定义的APL干样细胞的特征，通过比较图2a中APL干样细胞群（C15）和图1b中HSPC群的转录组数据，确定了APL特异性白血病干性基因。

首先，PML/RARα靶标明显富集在这些APL特异性白血病干性基因中（图3a）。LSC标记基因只在APL干样细胞中表达，而不在HSPC中表达。它们也是PML/RARα的直接靶标（图3b）。此外，干性/自我更新相关的PML/RARα靶标，在APL干样细胞中高度表达。与APL白血病发生密切相关的基因，如FLT3和JAG1，不仅是PML/RARα的靶标，而且在APL干样细胞中也有高表达（图3b）。

其次，进行了通路富集分析，以揭示PML/RARα失调信号通路参与APL干样细胞的情况。这项分析确定了许多与LSC相关的通路，包括经典的WNT、MAPK、VEGF、P53和mTOR信号（图3c），它们都对维持LSC群至关重要。

第三，进行了VIPER分析，以阐明参与PML/RARα诱导的APL干样细胞转录网络的潜在TFs（图3d）。通过与正常HSPCs比较，发现与干性相关的TFs被激活，这表明它们在调节APL细胞的干性中可能发挥作用。此外，在APL干样细胞中，观察到与组蛋白修饰相关的调节因子被激活。这些发现表明，它们可能参与了 APL 干样细胞自我更新和静止的表观遗传控制。与恶性转化和干性特性相关的TFs，也被发现在APL干样细胞中活跃。这些发现凸显了PML/RARα在单细胞水平上调控APL干样细胞的关键作用。

第四，继续将APL原始细胞的细胞结构与APL中常见的合作基因改变联系起来。如图3e所示，与其他研究的突变相比，FLT3-ITD与更原始的疾病表型明显相关，这表明FLT3-ITD的存在可能在增强白血病干性方面起着重要作用。进一步使用两种已建立的白血病干性评分，即LSC17和LSC6，来比较有FLT3-ITD和无FLT3-ITD的APL干样细胞的干性特征。分析结果显示，有FLT3-ITD的干样细胞得分明显高于无FLT3-ITD的干样细胞（图3f），支持了FLT3-ITD可能增强干性特征的观点。此外，在两名APL患者中进行了FLT3-ITD靶向scRNA-seq研究，证实了其在APL干样细胞中的高表达（图3g、h）。

图3 PML/RARα和FLT3-ITD在调节APL干样细胞特性中的关键作用

4. APL干性评分对APL早期死亡和治疗结果的预测能力

接着探讨了如何利用scRNA-seq定义的APL干样细胞来预测APL的临床障碍，即早期死亡的发生、风险分层和治疗结果。首先建立了基于解卷积的预测程序（图 4a），并证明了其稳健性和性能（图 4b）。在步骤 1 中，将 CIBERSORTx 算法应用于 scRNA-seq 数据，生成了 APL 特异性特征矩阵，其中涉及 6 个 APL 原始细胞群（即干样细胞、Prog 样细胞、GMP 样细胞、循环 GMP 样细胞、S100高表达GMP 样细胞和 MDP 样细胞）和 3 个非白血病细胞类型（即 T/NK、B 和红细胞）。第二步，从bulk RNA-seq 数据中准备了外显子模型每百万映射读数（TPM）的每千碱基转录本矩阵。第三步，采用支持向量回归（SVR）对特征矩阵和 TPM 矩阵进行解旋，得出系数矩阵。系数矩阵中每种细胞类型所占的百分比用于建立线性回归模型，以进行基准测试。在步骤 4 中，通过 LASSO 建立了一个 11 基因评分模型，以评估大量 RNA-seq 数据中 APL 原始细胞的干性，得分越高表示干性越强。此外，还设计了一个留一检验，以证明推断出的APL干样细胞比例的稳健性（图4b）。总之，该去卷积方法可以从大量APL转录组中准确预测APL干样细胞。

接下来，利用已建立的解卷积预测程序，研究了由323名APL患者53组成的大型队列，探讨APL干样细胞与APL患者临床特征之间的相关性。首先，较高比例的APL干样细胞与白细胞（WBC）计数升高和血小板计数降低显著相关（图5a）。结果表明，APL患者的APL原始细胞中APL干样细胞比例较高，可能会增加外周血中循环的倾向。其次，研究了APL干样细胞比例与APL患者复发性突变之间的关系。较高比例的 APL 干样细胞与 S 型 PML/RARα 转录本和 FLT3-ITD明显相关（图 5a）。此外，FLT3-ITD被确定为最重要的共现事件，支持了FLT3-ITD在增强APL干样细胞干性活性方面的重要性（图3f）。

鉴于APL干样细胞与潜在的不利预后因素密切相关，试图开发一种专为APL原始细胞定制的干性评分系统。采用LASSO算法，根据APL干样细胞的估计细胞比例建立了APL特异性干性评分，然后利用该评分量化每位患者白血病细胞的干性。确定了11个基因来构建APL干性评分，该评分与APL干样细胞的比例有显著相关性。然后，探讨了APL干性评分与预后的关系。高APL干性评分与较差的总生存期（OS）和无事件生存期(EFS)显著相关，但与无疾病生存期无关（图5b）。单变量Cox分析还显示，APL干性评分较高的患者预后较差，这反映在OS（图5c）和EFS（图5d）。APL干性评分越高，早期死亡风险越高（图5b）。结果强调了APL干性评分在评估APL风险方面的实用性。

图4 构建11个基因的APL干性评分

图5 APL 干性评分在预测 APL 预后和早期死亡方面的信息性

5. ATRA 对原始 APL 细胞分化的体内效应及其对早期死亡风险的影响

尽早使用 ATRA 对降低 APL 早期死亡率至关重要。随后，进一步探讨了ATRA治疗对APL细胞分级的体内影响，尤其关注原始细胞，因为它们的干性可能会影响治疗反应。对ATRA治疗两天后收集的三例患者的骨髓样本进行了scRNA-seq分析。首先，scRNA-seq 数据的对比分析显示，与治疗后样本相比，诊断 APL 样本富含更多原始细胞，而治疗后样本相对富含更多成熟祖细胞（图 6a）。特别是在治疗后第2天，治疗后样本中几乎检测不到干样细胞（图6b）。ATRA处理后，更成熟的GMP样细胞类型的百分比明显增加，而三种原始细胞类型（干样细胞、Prog样细胞和S100高表达GMP样细胞）的百分比下降，干样细胞在处理后几乎检测不到，这表明ATRA对原始APL细胞，尤其是干样细胞有明显的影响（图6c、d）。为了证实ATRA能诱导APL原始细胞向更成熟的祖细胞分化，还采用了既定的评分方法来量化白血病细胞的成熟度，观察到治疗后2天的样本与诊断时的样本相比，该评分显著增加（图6e），表明APL细胞在ATRA治疗后变得更加成熟。通过分析 7 例在 ATRA 治疗前后获得完全缓解的 APL 患者的bulk转录组也得出了类似的结果。如图6f所示，APL干样细胞的比例和白血病细胞的干性在ATRA治疗后明显下降，尤其是在第2天。

接下来，观察了造血分化相关CD标记物和TFs的表达变化，结果表明ATRA可诱导从APL干样细胞向更成熟细胞的逐步分化。在原始细胞类型中观察到APL干性CD标记物和TFs的显著下调（图6g）。相反，与成熟造血细胞系相关的标记物和 TF 在 ATRA 处理后上调（图 6h）。

在有早期死亡和没有早期死亡的 APL 患者中发现了 ATRA 诱导的不同转录反应。如图6i所示，在早期死亡的APL患者中，未观察到几种干性相关CD标志物和TFs的一致下调。同样，在早死患者中也未观察到与分化相关的CD标记物和TFs的持续上调（图6j）。研究结果表明，ATRA治疗对早期死亡的APL患者的干性程序影响较小，这可能解释了观察到的白血病细胞的干性活动与早期死亡之间的显著关联。

图6 体内分析显示 ATRA 直接靶向 APL 原始细胞（包括干样细胞）并诱导其分化和成熟

文章小结

该研究报告了对16例APL患者进行的全面单细胞分析，揭示了细胞组成及其对体内ATRA反应和早期死亡的影响。揭示了以白血病干样细胞为根基的 APL 病灶内的细胞分化层次。致癌的PML/RARα融合蛋白对APL的分化轨迹具有特异性调控作用。APL队列分析确定了白血病干细胞与白细胞计数升高和FLT3-ITD突变之间的关联。此外，还构建了APL特异性干细胞评分，该评分被证明可有效评估早期死亡风险。最后，发现ATRA诱导原始细胞分化，早期死亡患者表现出不同的干细胞相关转录程序。该研究对APL细胞层次结构进行了全面调查，为靶向治疗过程中的细胞动态提供了见解。文章整体思路清晰，结合了多组学数据，不仅有自己的一手数据，还收集了多组公共数据队列，采用了多种分析手段，逻辑严谨可靠，没有实验纯生信照样拿下1区高分确实令人佩服！！（ps：发文还缺好思路的同学们，欢迎来找馆长，超多新颖的分析思路供你选择哦！）

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