RNA-seq差异分析实战指南：利用DESeq2 R包精准解析差异表达并可视化基因调控！
当涉及到RNA-seq差异分析时，你是否曾经感到困惑或无从下手？本期，小果将带小伙伴们揭开RNA-seq分析的神秘面纱！RNA-seq技术为我们打开了一个全新的窗口，让我们能够深入了解基因表达的奥秘。而在这个探索过程中，DESeq2 R包成为了我们不可或缺的得力助手。凭借其强大的统计功能和精准的分析能力，我们可以精准解析RNA-seq数据中的差异表达。不仅如此，通过可视化手段，我们能够直观地洞察基因调控，并发现隐藏在数据背后的生物学意义。无论是基础研究还是临床应用，DESeq2都能为我们提供有力的支持。那么，你还在等什么？快来和小果一起探索RNA-seq差异分析的无限可能吧！同时呢，十年的生信之路，小果已经练就了一身扎实的本领，现在准备用这身本事为小伙伴们服务啦！如果你在生信分析上遇到了难题，那就来找小果吧！小果会用自己的专业知识和技能，为你解决困扰，助你一臂之力。期待你的联系哦~
一、DESeq2包简要说明
DESeq2包是一个为RNA-seq数据中的高维计数数据设计的R语言包，专注于数据的归一化、可视化和差异表达分析。其主要功能是利用经验贝叶斯方法（empirical Bayes techniques）来估计对数倍数变化（log2foldchange）和离差的先验值，并计算这些统计量的后验值。这也就是为什么DESeq2能够在RNA-seq数据中精确地探测基因差异表达的原因啦~
lDESeq2包差异表达分析步骤：
ØDESeq2首先对原始reads进行建模，使用标准化因子（scale factor）来解释库深度的差异。
ØDESeq2估计基因的离散度，并缩小这些估计值以生成更准确的离散度估计，从而对reads count进行建模。
ØDESeq2拟合负二项分布的模型，并使用Wald检验或似然比检验进行假设检验。
²小果提示：在进行差异表达分析之前，需要准备好输入数据。DESeq2包使用基于计数的RNA-seq数据作为输入。通常，我们需要将原始测序数据映射到基因或转录本水平，并计算每个基因或转录本的读数。
二、代码实操
小果这里将用一段代码和小伙伴们一起学习DESeq2包进行RNA-seq差异分析的一个典型流程。本次介绍的R包操作会占用内存较大，小果建议使用服务器，欢迎小伙伴们联系小果租赁性价比居高的服务器！
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l包的安装与加载：首先，检查是否安装了BiocManager，如果没有，则进行安装。
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) {install.packages("BiocManager")}BiocManager::install("DESeq2")library(DESeq2)
l进行模拟数据集的生成：小果这里使用了set.seed确保模拟结果的可重复性。定义条件和样本。使用rpois生成矩阵，模拟了基因在样本中的表达水平。
set.seed(123)conditions <- c("Condition1", "Condition2")samples <- paste0("Sample_", 1:6)counts <- matrix(rpois(60, 1000), ncol = 6)colData <- data.frame(sample = samples,condition = factor(rep(conditions, each = 3))
l创建DESeq2数据集对象：用DESeqDataSetFromMatrix创建DESeq2数据集对象dds，其中包含了计数数据和样本信息。
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = counts, colData = colData, design = ~ condition)
l数据预处理：先用estimateSizeFactors对数据进行标准化，以消除样本之间的大小差异，然后用estimateDispersionsGeneEst进行基因级别的离散度估计，并更新dds对象。
dds <- estimateSizeFactors(dds)dds <- estimateDispersionsGeneEst(dds)dispersions(dds) <- mcols(dds)$dispGeneEst
l差异表达分析：用nbinomWaldTest拟合负二项模型并进行差异表达分析。
dds <- nbinomWaldTest(dds)
l离散度分布的可视化：用plotDispEsts查看数据的离散度分布，这有助于判断模型的适用性。
plotDispEsts(dds, fitType="local")
l差异表达基因结果的获取与过滤：使用results获取差异表达分析的结果后通过subset过滤出FDR校正后P值小于0.05的显著性基因。
res <- results(dds)print(res)resSignificant <- subset(res, padj < 0.05)
l数据可视化（检查数据质量）：小果这里进行了多种可视化~plotMA绘制火山图，展示基因的log2 fold change和显著性水平；boxplot绘制箱线图，检查基因表达数据中的异常值；vioplot绘制小提琴图，展示基因表达数据的分布；stripchart绘制点图，展示每个样本中每个基因的表达量；heatmap3绘制热图，展示基因表达量的分布；pairs绘制散点图矩阵，展示基因表达量之间的成对关系。
plotMA(res, main="Volcano Plot")boxplot(assay(dds), las = 2, col = "skyblue", pch = 20,main = "Boxplot of Gene Expression Data")if (!requireNamespace("vioplot", quietly = TRUE)) {install.packages("vioplot")}library(vioplot)vioplot(assay(dds), col = "lightgreen", pch = 20,main = "vioplot of Gene Expression Data")stripchart(assay(dds), method = "jitter", pch = 20, col = "yellow",main = "Stripchart of Gene Expression Data")install.packages("heatmap3")library(heatmap3)heatmap3(assay(dds), scale = "row", col = heat.colors(100),main = "Heatmap of Gene Expression Data")pairs(assay(dds), col = "purple", pch = 20,main = "Scatterplot Matrix of Gene Expression Data")
l样本相关性分析：用dist函数计算样本间的欧氏距离，并使用heatmap3绘制样本相关性热图。
sampleDists <- dist(t(assay(dds)))sampleDistMatrix <- as.matrix(sampleDists)heatmap3(sampleDistMatrix, main="Sample Correlation Heatmap")
l主成分分析（PCA）：使用prcomp进行PCA分析，并通过biplot绘制前两个主成分的二维投影，以展示样本间的相关性。
pca_result <- prcomp(t(assay(dds)), scale. = TRUE)biplot(pca_result, scale = TRUE, col = as.numeric(colData(dds)$condition),pch = 19, main = "PCA Biplot of Sample Correlation")
三、文章小结
本期，小果为小伙伴们讲解了DESeq2 R包在基因表达数据分析中的应用。我们模拟了基因表达数据，并利用DESeq2进行数据预处理、差异表达分析，并通过火山图展示分析结果。此外，通过箱线图、点图、热图和散点图等多种可视化手段，深入探索了数据集的内在结构和样本间的相互关系。最后，通过主成分分析（PCA）进一步分析了样本间的相关性。整个过程不仅揭示了差异表达基因，还深入分析了对数据集。快来和小果一起尝试DESeq2，解锁你的基因表达数据之秘吧！希望本期的内容对你有帮助，期待我们下期再见！最后如果各位小伙伴们觉得自己运行代码太麻烦，欢迎用我们的云生信小工具，只要输入合适的数据就可以直接出想要的图呢，附云生信链接
（http://www.biocloudservice.com/home.html）。
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