3分钟读懂最受欢迎的单细胞测序平台10×genomics细胞分选，建库及测序
小果今天介绍单细胞测序平台中最受欢迎的10×genomics的原理。
单细胞测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是在单个细胞水平进行转录组学分析的技术。在单个细胞的分辨率下，科学家能真正的定义细胞类型特定的基因表达，分辨出细胞的异质性。这是过去RNA-seq所无法企及的。
在众多的单细胞测序平台中，10×genomics最受欢迎表现最亮眼。其采用了基于微滴的微流体技术来分选细胞，实现了真正的单细胞测序，并且保证了超高的细胞通量与细胞捕获效率，具有性价比高，时间周期短，不受细胞类型约束等优点
其平台提供多种产品，这也是其较其它公司的优势之一
单细胞建库测序流程
单细胞测序的三个基本步骤。
小果会从样本的制备开始，然后讲解10×genomics文库构建和测序的原理及其优势。
单细胞样本制备
单细胞样本的制备有以下几种方法。
1. Limiting dilution极限稀释
这一种常用的技术，手动使用移液器通过稀释分离单个细胞。这种方法效率比较低。
Micromanipulation显微操纵术
该技术非常经典，曾用于从早期胚胎或未培养的微生物中提取细胞，使用显微镜引导的毛细管移液，来从悬浮液中提取单细胞。然而，这些方法耗时且吞吐量低。
FACS
flow-activated cell sorting (FACS)，使用流式细胞仪来分选细胞。首先用荧光单克隆抗体标记细胞，该抗体识别特定的表面标记，并能够对不同的群体进行分类。或者，对于未染色的种群，负选择也是可能的。
但是上述三种局限性有，对起始细胞体积的要求（细胞数少于10000会难以分离细胞）以及需要对感兴趣靶向蛋白质的抗体。
Laser capture microdissection激光捕获显微切割
该技术利用计算机系统辅助的激光系统从固体样品中分离细胞。
与抗体结合磁铁筛选
该系统使用与抗体结合的磁铁来检测上皮来源的CTC（CD45-和EpCAM+）。例如，为了分离罕见的循环肿瘤细胞（CTC），CellSearch（第一个经过临床验证、美国食品药品监督管理局批准的测试）开发了一种系统来枚举患者血液样本中的CTC（图1f）。
Microfluidic technology微流体技术
用于单细胞分离的技术由于其低样品消耗和低分析成本以及能够实现精确的流体控制而广受欢迎。同时，该技术所需的nL大小的体积大大降低了外部污染的风险。
该技术最初用于少量的生物化学分析，用于DNA和蛋白质的分析。现在开发出了复杂的微流阵列，允许对阀门和开关进行单独控制，从而提高了它们的可扩展性。
近年来微流体技术的快速发展改变了基础科学家和临床医生的研究能力。该技术可以以高度并行的方式对单个细胞基因表达谱的量化。
几种单细胞分选技术比较
10× genomics 核心技术原理
10×genomics平台应用了先进的微流体技术以高捕获效率提供了单细胞RNA 3′端的高通量分析。因此，这种高通量处理方法能够在足够异质的生物空间中分析稀有细胞类型。目前10×genomics已成为单细胞测序最受欢迎的平台。
下面继续由小果带大家了解一下它的核心技术原理。
GEM（gel bead inemulsion）凝胶珠乳液
每个bead上面有READ1, Barcode, UMI, Poly(dT)VN
READ1 ：包含测序用的接头adaptor, Index, 测序引物。
Barcode，每个GEM带有唯一的Barcod条形码，用来区分细胞，识别不同的细胞。通常有16bp，共4的16次方种变化。
UMI：特异的分子片段，用来标记reads。用来解决pcr扩增引入的偏差， 偏差对单细胞影响很大。通常每个beads拥有一组不同的UMI。
Poly(dT)VN：与mRNA的PloyA尾互补，用来捕获细胞内，。
CB即cell barcode, 不同版本CB与UMI的长度变化。
10×genomics单细胞分选
该平台的单细胞分离技术是基于微滴的微流体。它允许水滴在连续油相中单分散。
GEM会从左往右流动，在第一个十字路口，样本细胞会进入和凝胶珠结合，在第二个十字路口会被油滴包裹，实现单细胞的捕获。与标准微流体室相比，该系统所需的细胞体积更低，能够以更低的成本操作和筛选数千至数百万个细胞。
超高的细胞通量
①孔加入细胞样本，②孔加入凝胶珠，③加入油滴
每个微流孔有八条line，每个line，10000个细胞，每次 通量可达8万。
10×genomics建库测序流程
1.油滴凝胶珠捕获单细胞。
2.单细胞裂解，凝胶珠上的PolyT会捕获mRNA的PloyA尾
3.测序
4.按照barcode分类细胞
5.按照UMI去重复reads
建库
10× genomics测序与illumina契合度很高，与illumina平台建库方法差不多
1.PolyT捕获mRNA
2.mRna打断
3.第一链合成
4.第二链合成
5.3’与5‘端修饰
6.连接adapter
7.PCR扩增
测序
Read1:P5接头与ilumina一样，Read1包含接头adaptor, Index,测序引物等从绿色的部分开始测测到UMI. 最后测16+12=28bp.
Read2:从底部链TruSeq开始测，测91bp，
read2测到的是mRNA序列信息，read1测的是barcode,UMI
10×genomic测序的结果是3‘端数据
优势：
1.真正单细胞测序
2.超高细胞通量
3.细胞捕获效率高
4.细胞可适性高
5.多态率低
6.时间周期短
7.性价比高
总结：
1、文库构建时有很多种类的GEMs
2、通过合理控制每次输入的细胞数，来最终控制检测的细胞数;目前平局可以检测3000-8000个细胞;
3、一般来说，约有65%的GEM在10X芯片的管道中可以成功捕获细胞，但也有35%没有捕获细胞，称为空载;
4、空载的GEM并非没有任何结果。由于单细胞悬液中存在细胞破裂产生的游离RNA因此空载GEM中也会扩增得到少量RNA的信息，但基因数会很少
5、有部分GEM中会包含两个细胞称为doublets，超过两个称为multiplets。6、最终要将空载或者过载的非单细胞过滤掉
6、和ilummina平台关系紧密，可以收10×genomics设备用来捕获单细胞，测序在ilumina平台测序。
7、细胞破碎后，样本混合在一起测序，通过barcode来识别细胞，有多少barcode就有多少细胞。每个细胞里面有多少条UMI就测了多少条reads。
8、注意用新鲜组织细胞，若细胞死亡裂解，凝胶珠会捕捉游离的RNA。
好了小果今天关于10×genomics的分享就到这里了，小伙伴们，今天有没有学到新知识呢，想要继续了解R语言内容可以持续关注小果哦～或者也可以关注我们的官网也会持续更新的哦～
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