在本研究中，作者通过对 33 种癌症类型和 30 种正常组织进行全面的多组学分析，开发并验证了一种定量指标，用于评估 DR 相关分子活动的水平。首先在泛癌症水平上确定了 DR 与基因组变异和免疫分子特征的特定关联。此外，对 939,718 份单细胞图谱的调查显示，DR 相关分子活动表现出瘤内异质性，并与肿瘤细胞和免疫细胞之间的细胞-细胞旁分泌通讯有关。此外，DR 相关分子活性水平与肿瘤免疫调节有显著关联，有望预测各种癌症类型的免疫疗法反应。重要的是，研究结果表明，较高水平的DR相关分子活性与总生存期（OS）和癌症特异性生存期（CSS）的改善有关。主要结果1. DR 相关分子活动的量化为了量化与 DR 相关的分子活动，从 GenDR 数据库中获得了 276 个与 DR 相关的基因。对于该数据集，将因实施 DR 而上调的基因归类为与 DR 正相关的基因，而下调的基因则被视为与 DR 负相关。假设与 DR 相关的更活跃的分子特征会使与 DR 正相关的基因和与 DR 负相关的基因之间的活性产生更明显的差异。采用 GSVA 算法来推断每个样本中与 DR 正相关和负相关基因的活性，然后定义了 “DR 评分”，它可以反映这两组活性之间的差异（图 1a）。
然后，计算了 TCGA 数据库中 33 种癌症类型的 9938 个样本和 CCLE 数据库中 31 种癌症类型的 1348 个细胞系的 DR 评分。图 1c 显示了每种癌症类型特有的 DR 相关分子活动的分布情况。一般来说，TCGA 数据库和 CCLE 数据库中的大多数癌症类型的 DR 平均得分都低于 0。与相应的正常组织相比，TCGA 中几乎所有癌症类型的肿瘤组织中的 DR 评分都明显较低，这表明肿瘤微环境中 DR 相关分子活性水平的升高可能会抵消肿瘤的生长（图 1e）。通常与葡萄糖代谢活跃有关的组织，如脑、肝、肾和甲状腺肿瘤，在 TCGA 和 GTEx 队列中都表现出相对较高的 DR 评分。TCGA和GTEx中DR得分的一致趋势表明，组织类型可能在决定DR相关分子活动的程度方面起着至关重要的作用。
图1 全面量化癌症和组织中与 DR 相关的分子活动
2. DR评分的异质性以及与肿瘤免疫微环境的关系采用了10个scRNA-seq数据集，共830,178个细胞，涉及10种实体瘤，分别来自173名癌症患者和65名正常供体，以评估DR评分的异质性以及DR评分与肿瘤微环境之间的关联。与bulk RNA 序列数据一致，与肿瘤微环境中的细胞相比，正常组织中的细胞通常表现出更高的 DR 评分（图 2a）。此外，在比较肿瘤细胞和正常细胞时，在 4 个细胞系中观察到较高的 DR 评分，仅在基质细胞和淋巴细胞中观察到统计学意义（图 2b）。为了探索不同癌症类型的 DR 评分异质性，比较了正常组织和肿瘤中不同细胞类型的 DR 评分（图 2c 和 d）。正如预期的那样，与正常组织中的细胞相比，肿瘤微环境中的大多数基质细胞和免疫细胞表现出较低的 DR 评分，这表明肿瘤微环境中与 DR 相关的分子活性偏好降低。这也可能表明，肿瘤细胞会夺走周围正常组织细胞的营养，导致这些细胞的 DR 评分降低。为了研究肿瘤微环境中 DR 相关分子活性的瘤内异质性的影响，分析了 8 例 KIRC 患者（GSE159115）的 15,000 个细胞的 DR 评分。该数据集中的癌细胞和免疫细胞被分为高DR、中DR和低DR。研究结果表明，DR 评分的升高与肿瘤细胞的新陈代谢密切相关（图 2e）。此外，高DR组对异种生物刺激的反应增强，可能会影响免疫细胞的趋化活动（图2e）。此外，肿瘤内较低水平的DR评分与肿瘤血管生成增加有关，这表明低DR肿瘤细胞可能在很大程度上促进了肿瘤的生长（图2e）。此外，细胞-细胞旁分泌通讯分析显示，DR评分与肿瘤细胞间的细胞-细胞相互作用数量呈负相关。低 DR 组的肿瘤细胞相互作用次数最多，这表明它们在肿瘤微环境中的活性增强（图 2f）。同时，高 DR 组的免疫细胞参与了细胞氧化物解毒过程，该过程对氧化还原系统至关重要，并与抗肿瘤发生有关。此外，还发现低 DR 组免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用增加，这表明低 DR 组免疫细胞受到了肿瘤细胞的巨大影响（图 2h）。
然后，利用来自 16 名 GBM 患者的 16 个病理切片、51,850 个斑点的 ST 数据集，进一步研究了 DR 评分与肿瘤免疫微环境在空间层面上的相关性。根据免疫细胞的空间分布，将其分为三组：肿瘤内、界面上和基质中（图 3a）。肿瘤内的免疫细胞平均 DR 评分最低，而基质中的免疫细胞平均 DR 评分最高（图 3b）。随着免疫细胞与肿瘤细胞距离的增加，DR评分显著下降。此外，通过细胞间的相互作用，发现肿瘤内的免疫细胞与其他位置的免疫细胞相比具有更高的网络得分，这表明它们积极参与了与肿瘤的交流（图 3c）。这些结果凸显了 DR 分数反映肿瘤微环境中免疫细胞活跃状态的能力，强调了免疫细胞与正常组织中的免疫细胞相比的独特状态。
图2 肿瘤微环境中 DR 相关分子活动的异质性
图3 空间转录组揭示了 DR 评分与肿瘤免疫微环境之间的关联
3. DR 与特定癌症类型基因组变异的关系基因组不稳定性被广泛认为是癌症和衰老的一个特征。然而，不同类型癌症的基因组改变在多大程度上会随 DR 相关分子活动水平的变化而变化，这一点仍有待阐明。在本研究中，调查了 DR 评分与两类基因组改变之间的关联：SNV 和 CNV。 对于SNVs，首先通过一个根据年龄、性别和种族进行调整的多元线性回归模型研究了DR评分与突变负荷之间的关系。癌症特异性分析表明，在 8 种癌症类型中，DR 评分与突变负荷呈显著负相关（图 4a）。随后，分别检测了每组中前 20 个突变的致癌基因（图 4b 和 c）。TP53、TTN、MUC16和PIK3CA突变是两组中观察到的前四个突变事件，但低DR组中这些基因的突变频率几乎是高DR组的两倍。数据显示，低 DR 组肿瘤中的 PIK3CA 发生有害突变的概率可能更高，从而使癌细胞对 DR 的反应性降低。此外，在低 DR 组前 20 个发生突变的致癌基因中，发现了与肿瘤进展密切相关的突变，如 APC 和 FAT3 中的突变，这表明低 DR 患者的肿瘤恶性程度更高。与 SNV 相似，观察到 DR 评分与近一半癌症类型中 CNV 事件的发生呈负相关，如 LIHC、KIRC和 COAD（图 4d）。此外，还发现癌症类型特异性臂水平 CNV 事件相对集中于 DR 评分较低的 LIHC 患者的某些染色体臂（图 4e 和 f）。先前的研究表明，19q 和 20q 的扩增以及 3p、13q 和 17p 的缺失与 LIHC 患者的转移和不良预后相关。
进一步研究了基因组异质性与 DR 评分之间的相关性。如图 4g 所示，发现 DR 评分与大多数癌症类型的肿瘤纯度呈正相关，这与单细胞分析显示肿瘤微环境中非肿瘤细胞的 DR 评分降低相吻合。此外，尽管存在异质性，但在几种癌症类型（包括 LIHC、KIRC 和 BRCA）中，DR 评分与肿瘤倍性、肿瘤突变负荷 (TMB)、HRD 和 LOH 呈负相关。这些研究结果表明，DR评分较低的特定癌症类型（如LIHC）更有可能表现出基因组不稳定性。
图4 泛癌症层面上 DR 评分与基因组变异之间的关联
4. DR与免疫浸润和预后的关系在 TCGA-LIHC 队列中，高 DR 组患者的总生存期明显优于低 DR 组（图 5a）。此外，DR 相关分子活性水平越高，肿瘤分级和 T 分期越好（图 5b）。鉴于肿瘤中大量的免疫浸润通常被视为预后因素，进一步研究了 DR 评分与免疫浸润之间的关系。通过ssGSEA算法，对肿瘤中16种免疫细胞的组成进行了分卷，并量化了13种免疫功能通路的活性。DR评分高的患者肿瘤中的免疫浸润水平明显较低（图 5c）。相反，DR评分低的患者则表现出免疫功能通路的活性增加（图 5d）。
为了验证观察结果，根据 276 个 DR 相关基因的转录组表达进行了共识聚类分析。根据共识矩阵，LIHC 患者被分为两组（k = 2）（图 5e）。第一组主要由高 DR 评分的患者组成（约 75%），而第二组中约 70% 的患者为低 DR 评分（图 5f）。Kaplan-Meier 分析显示，与群组 1 相比，群组 2 患者的预后较差（图 5g）。KEGG 通路中免疫相关通路的层次聚类分析显示，大多数第 2 组患者普遍存在免疫激活模式（图 5h）。研究结果表明，DR 相关分子活性与免疫浸润呈负相关，而与生存期延长呈正相关。
图5 确定 DR 评分的临床相关性
5. DR 与泛癌中免疫检查点和免疫调节的关系在大多数癌症类型中（33 种癌症中有 21 种），总免疫细胞的免疫浸润丰度与 DR 评分显著相关，而且大多数癌症的免疫浸润与 DR 评分呈负相关（图 6a）。然而，特定免疫细胞的浸润在不同癌症类型中各不相同，DR 评分与免疫浸润之间的相关性也相应不同。例如，在 LIHC 中，DR 评分与免疫抑制调节性 T 细胞（Tregs）的浸润呈负相关，但并非所有癌症类型都是如此。这一结果表明，在DR评分较低的LIHC患者肿瘤中存在免疫抑制微环境。为了进一步研究 DR 与免疫特征之间的关系，分析了 DR 评分与免疫检查点基因表达之间的相关性。如图 6b 所示，在大多数癌症类型中，DR 评分与免疫检查点基因的表达呈显著负相关。观察到大多数癌症类型，如 LIHC、LUAD、BLCA、BRCA 和 GBM，在低 DR 组中都表现出 PD-L1 转录物和蛋白的表达增强（图 6c 和 d）。此外，还研究了 DR 评分与免疫细胞溶解活性（CYT）评分之间的相关性。CYT 评分是根据粒酶 A（GZMA）和穿孔素（PRF1）转录本的平均值计算得出的，它是通过评估 T 细胞细胞毒性浸润来预测免疫反应的生物标记物。这些研究结果表明，DR评分低、PD-L1表达高且细胞溶解性T细胞充足的肿瘤可能会在相应的微环境中表现出对免疫疗法更高的敏感性。
