新一年的肿瘤研究方向就看这篇！Science、Nature、Cell共推的“瘤内菌”怎么做？复旦大学中山医院12+的经典思路！
“机制难寻，肠道菌群”，微生物这个“筐”已经装了太多东西了！
以“肝肠轴”、“脑肠轴”等为代表的研究，表明肠道菌群与靶器官之间存在相互作用关系，但是靶器官本身的微生物是否在疾病发病和治疗中具有作用，却是一片蓝海。
自2020年，Science首次揭示瘤内菌群的存在，肿瘤研究似乎找到新的秘籍，开始不断投入到肿瘤相关微生物的研究，Nature、Cell及其子刊上瘤内菌群文章也相继涌现，瘤内菌群也当之无愧的成为了新晋国自然热点，特别是瘤内菌群和近几年最热门的“肿瘤微环境”、“免疫治疗”等先天八字绝配，两者的整合研究自然成为肿瘤研究最前沿之一。
今天小途给大家带来的就是复旦大学附属中山医院发表在Gut Microbes（IF：12.2），该研究可谓是瘤内菌的研究典范：从临床样本16s测序入手，来初步表明ICC存在瘤内菌，再通过FISH等实验确认了瘤内菌的存在；进一步的单细胞分析证明瘤内菌与不仅存在肿瘤细胞内，还存在于免疫细胞中；最后筛选出单个菌株并进行体内、体外的功能验证，可谓循序渐进一条龙。在当前肿瘤研究竞争白热化的前提下，瘤内菌作为新的热点方向，可以和肿瘤微环境，特别是免疫治疗等角度进行挂钩，可谓强强联手，作为2024年肿瘤研究的首要创新角度，大家一定不要错过了。感兴趣的小伙伴，快来找小途复现吧！
题目：肿瘤内微生物组分析揭示其对肝内胆管癌的抑制价值
杂志：GutMicrobes
影响因子：IF=12.2
研究背景
肝内胆管癌（ICC）在中国和东南亚地区发病率较高，恶性程度高，预后差。尽管已以“肠肝轴”为代表的研究表明肠道菌群与肝脏之间存在相互作用关系，但是肝脏本身的微生物是否在肝内胆管癌发病和治疗中具有作用，却缺乏深入研究。该研究旨在通过scRNA-seq等手段阐明ICC组织的细菌宏基因组学特征，并探索其抗肿瘤潜力。
研究方法
在该研究中，作者首先对ICC患者癌与癌旁组织进行了16SrRNA测序，并使用计算生物学方法对ICC患者组织中的细菌进行了定量。同时，通过细菌培养和透射电子显微镜（TEM）实验证实了胆管癌组织中细胞内细菌的存在。此外，作者通过体外和体内实验验证了Paraburkholderia fungorum的生物学功能，代谢组学数据表明它可能通过参与氨基酸代谢途径影响肿瘤生长。
主要结果
1.16SrRNA测序揭示ICC患者独特的微生物组特征
作者从 52 名 ICC 患者中收集了 94 个临床样本（42 个配对的肿瘤 (T) 和癌旁 (P) 组织）。进一步的16SrRNA测序分析显示，肿瘤和邻近组织之间的微生物组成总体上相似，与正常肝组织相比，肿瘤和癌旁组织的微生物组成差异更大（图1）。需要特别注意的是，为了避免环境中的微生物污染影响分析结果，作者应用Decontam来去除操作环境中的污染细菌，同时，作者设置了测序的阴性对照组，并在最终各组的测序结果中，去除了阴性对照中的污染细菌并过滤掉个别低质量样本，以最大限度的降低污染。
图1ICC组织中细菌微生物群的组成分析
2.实验确认组织中存在活细菌和细胞内细菌
虽然上一步的测序提示了肿瘤组织中有特异的细菌，但是这细菌是否真实存在于肿瘤组织甚至是肿瘤细胞内，仍需进一步验证。作者使用了FISH、HE染色等方法，显示ICC组织中存在DNA。对新鲜肿瘤组织通过体外培养，分离获得了细菌，进一步的质谱通过质谱鉴定出头状葡萄球菌Staphylococcus capitis。最后，通过电镜检测也证实了 ICC中的瘤内菌（图2）。
图2实验验证表明组织中存在细菌
3.单细胞转录组数据显示细菌DNA转录产物在免疫细胞中富集
作者分析了来自ICC患者的三个临床组织样本（肿瘤、癌旁组织和血浆组织）的scRNA-seq数据，细胞注释后发现，细菌RNA不仅存在于胆管细胞和肝细胞等实质细胞中，还存在于多种免疫细胞中。差异表达结果显示，癌组织恶性细胞中细菌丰度高于癌旁组织，而癌组织T细胞中细菌丰度低于癌旁组织。
图3 scRNA-seq分析揭示每种细胞类型中细菌RNA的存在
4.ICC临床治疗效果相关菌群鉴定
收集患者的临床信息，探讨瘤内微生物丰度与临床因素之间的关系，发现癌抗原CA199与肿瘤组织细菌Burkholderia tuberum和P.fungorum的数量呈负相关，并且与该细菌在ICC癌旁组织中的高表达相关，推测它们可能具有抗肿瘤特性。
图4环境因素分析显示细菌丰度与临床数据的相关性
5.差异表达分析显示伯克氏菌在癌旁组织中具有较高的生物量
考虑到癌和癌旁组织之间的差异，作者计算了它们不同菌落在物种水平上的特征。
P.fungorum和P.azotoformans在癌和癌旁组织中有显著差异，二者在癌旁组织中的含量比在癌组织中的要高。作者由此猜想，癌旁组织中含量较高的细菌对肿瘤的发展有抑制作用，这与P.fungorum的荧光半定量分析结果相似。
图5肿瘤组织和癌旁组织细菌含量的差异分析
6.P.fungorum抑制肝内胆管癌细胞的迁移和增殖
通过MTT实验、Transwell实验和划痕实验在体外发现P.fungorum代谢物对癌细胞的表型有显著影响。接着在体内实验中表明，P.fungorum移植组小鼠的肿瘤体积相对于对照组有所减少。FISH实验，验证了小鼠肿瘤中P.fungorum的存在，进一步说明体内实验的准确性。
图6.体外和体内测定显示P.fungorum对肿瘤生长的抑制作用
文章小结
本研究可谓是瘤内菌的研究典范：从临床样本测序入手，来初步表明ICC存在瘤内菌；进一步FISH等实验确认了瘤内菌的存在；单细胞分析证明瘤内菌与不仅存在肿瘤细胞内，还存在于免疫细胞中；进一步筛选出单个菌株并进行体内、体外的功能验证，可谓循序渐进一条龙。在当前肿瘤研究竞争白热化的前提下，瘤内菌作为新的热点方向，可以和肿瘤微环境，特别是免疫治疗等角度进行挂钩，可谓强强联手，作为2024年肿瘤研究的首要创新角度，大家一定不要错过了。感兴趣的小伙伴，快来找小途复现吧！
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