2024-06-16

基于TBtools做基因家族分析 | 生信部分

BioinfoDu 生信果 2023-05-10 19:01:07

转自公众号：小杜的生信筆記
http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwODY5NDU0MA==&mid=2455852626&idx=1&sn=fcfea2bd0dc4947c547e4a6ec58aeb8e

一、写在前面

2023年4月中旬自己开始做基因家族的分析，对于这块自己没有接触过，因此也是一个挑战，没事！！！（安慰自己），对于基因家族的分析网上的教程很多，跟着步骤走就可以。在这部分，我自己主要是做生信这块，实验验证是师姐在做，所以论文结构自己不用操心。此外，可视化的工具很多，也很方便，不需要自己特意去学。我们这里就80%使用TBtools软件进行可视化和分析。

此外，本次分析80%的内容都是基于TBtools。确实牛X!!自己开始接触TBtools是在2019年吧，也是通过一个师兄的推荐才知道的。2019年CJ还没将TBtools发表在MP上，那时还是预印版本吧。但是，引用已经有了很多，了不起哦。后面TBtools一直在开发新的的小“软件” or“程序”，将生信分析的门槛一降再降。点赞点赞！！！

–Du

「如想获得本文文档，可看文末！！」

「注意：此教程有些话语可能会带有自己的方言，读不通时也不要在意！！[泪目！]」

一，在Pfam数据中获得基因家族

我们这里预测作物中某一个基因家族的基因，目前在此作物中未报道。因此，使用Pfam数据库中一致的基因进行同源搜索（其实，你也可以使用已知作物中的基因进行同源搜索，获得结果基本一致）。那么我们就根据文章中和报道的Pfam数据库中的基因作为基序，进行同源搜索。

在Pfam数据库中下载FBNs基因家族（Pfam 04755)，Pfam网址：https://pfam-legacy.xfam.org/
打开网址:http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/?search=0477#table

点击进入PF04775，下载所有的Proteins序列

以上只是其中的一种方法，但为获得FBN基因家族的蛋白序列。下面使用Pfam数据中搜索

打开网页。https://pfam-legacy.xfam.org/
搜索
进入
搜索后获得PAP_fibrillin下载Reviewed的PF04755序列

二、同源序列检索预测

对于同源基因的搜索，很多基因家族的文章都使用HMMER进行检索，也有一些文章是使用BLAST。你任选其中一个即可，都能获得你想要的结果同源基因。在做分析的时候，我将使用Hmmer寻找同源基因的文章分享在公众号中，在评论区有一个大佬对HMMER和BLAST之间的差异给出回答。

这两个方法原理上区别，balstp是基于序列同源性进行打分的，有打分矩阵，hmm是基于隐马尔可夫模型，对序列结构域进行比对。「来自“泼皮混混”的评论。」

2.1 HMMER同源结构域搜索

2.1.1 Hmmer的安装

安装，主要是使用源码安装或是是使用conda进行安装即可。

「conda安装」

conda install -y hmmer

「源码安装：」「官网」：http://www.hmmer.org/任意下载一个版本即可，安装步骤不再做说明。

2.1.2 使用hmmbuild构建.hmm文件

在有些数据库中是有.hmm文件，只需要下载即可。但是，这仅仅只限于有些大数据库。对于我们自己使用，不可能全部都有，这就需要我们自己构建，**很多教程到这步就是让你收费了…….**。

本教程，讲述其中一种方法吧，希望对大家有所帮助。

❝

hmmbuild构建时，需要使用.sto文件进行构建。因此，我们必须获得.sto文件。

❞

使用mafft软件进行间序列进行对齐

mafft --auto --clustalout ../Pfam_PF04755_reviewed.fasta > Hmmbuild_index/Pfam.FBNs.align.clustal

转换：http://sequenceconversion.bugaco.com/converter/biology/sequences/fasta_to_phylip.php

hmmbuild构建文件

hmmbuild Pfam.FBNs.hmm sample.stockholm

hmmsearch

hmmsearch Hmmbuild_index/Pfam.FBNs.hmm Potato/DM_1-3_516_R44_potato.v6.1.working_models.pep.fa > ../02_Result/Potao.hmmer.out.txt

筛选出最佳的结果，E-value值小于1e-5,Score值大于“> 90”
对于筛选结果，可以直接使用Hmmsearch获得结果；也可以如上所示根据自己需求进行筛选，自己做的话，如果搜索的目的基因太多，而自己不需要这么多的同源基因，自己会进行手动过滤一些同源性较弱的基因。

cat Potato.hmmer.out.txt |grep -v "#" | awk '{if($4 < 1e-5 && $5 > 90) print $9}' | sort | uniq | grep -v "+" > Potato.hmmer.best.out.txt

2.2 提取目的基因序列

日志：通过Hmmsearch获得同源基因的ID，那么后面对目的同源基因进行进化树、结构域、motif等的分析，这些分析都需使用目的同源基因的序列。

「如何获得同源基因序列？？」

使用脚本获得
使用ggffead获得，需要获得同源基因的.gtf文件等信息。
生信工具获得、如TBtools等。

对于这步、我们就多做讲解，使用自己拿手的方式获得即可。

问：「后面的分析使用核酸序列 or蛋白序列呢？？」

答：「都可以。」

FBN 家族的分析日志。使用Pfam、拟南芥（11）和水稻的FBN家族基因同源搜索马铃薯中的FBN同源基因

## 水稻中的FBN家族基因
cat all.pep | grep ">" | grep fibrillin |awk -F "|" '{print $1}' | awk -F " " '{print $1}' | sed 's/>//g' > O_sativa.FBN.id.txt

##拟南芥中FBN家族基因
可以在拟南芥网址中的同源搜索，也可以在拟南芥蛋白数据中搜索
cat Araport11_pep_20220914 | grep FBN | awk -F "|" '{print $1}' | sed 's/>//g' > Araport11_FBN.id

2.3 使用TBtools提取目的基因

说实话，TBtools确实是个很牛的生信工具，基本可以让你不写代码获得你想要的东西。以及，各种类型的小脚本软件都一直在开发。赞赞！！

2.3.1 TBtools软件的下载

网址：https://github.com/CJ-Chen/TBtools
安装。
动手运行

2.3.2 提取序列

准备作物所有的蛋白序列文件（or基因文件）
目的基因的ID
打开TBtools，Fasta Extract or Filter (Qyick)
获得结果

##2.4 目的同源基因motif分析

2.4.1 使用MEME进行motif预测

网址：https://meme-suite.org/meme/tools/meme

上传相关的fa文件，以及修改相关的参数，进行提交
输出结果输出结果很快，有以下几个结果文件。

2.4.2 motif可视化

对于motifi分析可以参考一下文章：

TBtools | 多图合一至强版教程！进化树 + Motifs + 结构域 + 启动子 + 基因结构 + ….,TBtools开发者本人的教程
TBtools | 基因家族分析 (进化树、Motifs、结构域)
「或是本篇教程」

MEME网址结果可以给我们的seqlogo信息和motif信息。

「Seqlogo」结果文件中就有seqlogo文件信息。也可以自己的下载后绘制。按以下操作即可下载序列。也可以下载已有的seqlogo图片。下载后所有的motif序列信息。

使用R语言对Seqlogo序列进行可视化
这里借用这篇教程，基因结构及motif分析。批量生产Seqlogo可视化。

我们可以根据自己的motifi数量进行命名，我自己只有10个motif信息。所以命名为motif1-10.txt。

## 加载所需要的包
library(ggplot2)
#BiocManager::install("ggseqlogo")
library(ggseqlogo)

## 批量生产文件名
filelist = c(paste0('motif',1:10,'.txt'))
filelen <- length(filelist)

##批量读取
data.list <- list()
for (i in 1:filelen) {
  data.list[[paste0('motif',i)]]=scan(filelist[i],what = '')
}

ggseqlogo(data.list,col_scheme="clustalx", ncol = 5)+
  theme(axis.line = element_line(colour = 'black'),
        axis.text.x = element_blank(),
        legend.title = element_blank())

ggplot()+
  geom_logo(data.list, col_scheme = "clustalx")+
  theme_logo()+
  facet_wrap(~seq_group,ncol = 5,scales = "free_x")+
  theme(axis.line = element_line(colour = 'black'),
        axis.text.x = element_blank())

对比一下MEME网站中的图形。对于Seqlogo的绘制，美化，可以根据很多优秀的教程。在网上上一搜，都可以找到。

2.4.3 motif的分析

下载结果文件MAST XML output，使用TBtools软件进行可视化。
打开TBtools中的Gene Structure View,只需上传MEME中的XML文件即可，上传上去直接点击Start。—
操作：结果：保存！！

注意：我们这里保存的时候最好保存为PDF或SVG格式，输出为「矢量图」。

如果我们的教程只是到这里，那么就没有什么意义了。因为，类似非常优秀和详细的教程很多。「绘制出图形是一方面、美化可是重头戏」。

在MEME输出文件中，也提供了motif的图形，也可直接使用。

2.5 基因家族保守结构域分析

使用Batch CD-Search进行预测，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi
提交序列信息即可
Batch CD-search只支持目的基因「蛋白序列」信息, 以及序列数量少于1000。

Warning: Batch CD-Search accepts only 「protein sequences」. The maximal number of query sequences per request is 「1000」. A single query sequence can not exceed a length of 40,000 residues.

可以提供你的邮箱，等运行结束后，直接发送到你的邮箱。如果序列较多，建议提供邮箱。

下载文件结果文件：
打开TBtools中的Visualize NCBI CDD DOmainPattern
输入结果文件和fa文件
根据自己的需求进行调整即可。
输出文件。

2.6 进化树分析

进化树分析，在基因家族中是必须的，以及在很多图中都是需要的。进化树分析和绘制，也有很多教程，参考iqtree+ggtree绘制进化树教程、或是你也可以使用MEGA来做分析。

2.6.1 iqtree+ggtree绘制进化树教程

「参考」：iqtree+ggtree绘制进化树教程

iqtree获得树文件

「所需软件」

mafft

iqtree「mafft安装」我是使用服务器中运行的，安装可以使用conda

conda install mafft

「iqtree官网」

http://www.iqtree.org/

iqtree功能很强大，大家可以查看软件的官方文档。「安装」

conda install iqtree

软件安装好后直接运行即可。

序列准备

进化树序列可以使用蛋白序列或核酸序列即可，格式按其准备即可。

>B2LU34
MTSIAFWNAFTVNPFPAAARRSPPPLTPFTSGALSPARKPRILEISHPRTLPSFRVQAIAEDEWESEKKALKGVVGSVAL
AEDETTGADLVVSDLKKKLIDQLFGTDRGLKATSETRAEVNELITQLEAKNPNPAPTEALSLLNGRWILAYTSFAGLFPL
LGAESLQQLLKVDEISQTIDSEGFTVQNSVRFVGPFSSTSVTTNAKFEVRSPKRVQIKFEEGIIGTPQLTDSIVIPDKFE
FFGQNIDLSPFKGVISSLQDTASSVAKTISSQPPIKFPISNSNAQSWLLTTYLDDELRISRADGGSVFVLIKEGSPLLT
>B4F6G1
MTSIAFCNAFTVNPFLAAARRSPPPLTPLTSVALSPARKPRILAIFHPRTFPSFRVQAIAEDEWESEKKTLKGVVGSVAL
AEDEKTGADLVVSDLKKKLIDQLFGTDRGLKATSETRAEVNELITQLEAKNPNPAPTEALSLLNGKWILAYTSFVGLFPL
LGAESLQQLLKVDEISQTIDSEGFTVQNSVRFVGPFSSTSVTTNAKFEVRSPKRVQIKFEEGIIGTPQLTDSIVIPDKVE
FFGQNIDLSPFKGVISSLQDTASSVAKTISSQPPIKFPISNSNAQSWLLTTYLDDELRISRADGGSVFVLILESSPLLT
>O49629
MATVQLSTQFSCQTRVSISPNSKSISKPPFLVPVTSIIHRPMISTGGIAVSPRRVFKVRATDTGEIGSALLAAEEAIEDV
EETERLKRSLVDSLYGTDRGLSASSETRAEIGDLITQLESKNPTPAPTEALFLLNGKWILAYTSFVNLFPLLSRGIVPLI
KVDEISQTIDSDNFTVQNSVRFAGPLGTNSISTNAKFEIRSPKRVQIKFEQGVIGTPQLTDSIEIPEYVEVLGQKIDLNP
IRGLLTSVQDTASSVARTISSQPPLKFSLPADNAQSWLLTTYLDKDIRISRGDGGSVFVLIKEGSPLLNP

mafft比对

使用mafft将序列对齐。

mafft test.fa > test.aligend.fa

我们获得对齐后的数据格式。

iqtree构建树

iqtree -s test.aligend.fa -m MFP -bnni -nt AUTO -cmax 15 -redo -bb 1000

关于iqtree的使用，可以看这篇教程IQ-TREE的使用 – 超快速用极大似然法构建进化树，讲的很详细。

「必须参数：」

-s 输入多序列比对文件
-nt 多线程，AUTO是自动多线程
-bb 1000 指定了要用快速BS法做1000次

最终，我们可以获得以下结果文件。

ggtree绘制进化树

这里，我们使用基迪奥的教程，如何绘制添加分类色块的进化树？,这个教程也是讲解得很详细。

注意：我们这里使用iqtree输出文件test.aligend.fa.treefile作为输入文件。

#载入相关的R包；
library(ggtree)
library(treeio)
library(ggplot2)
#读入newick格式的进化树文件；
tr = read.newick("test.aligend.fa.treefile")
ggtree(tr)

#为进化树添加叶标签；
p1 <- p0 + geom_tiplab(size=2,color="grey10")
p1

#为进化树添加圆形顶点；
p2 <- p0+ geom_tiplab(size=2,offset=0.03, color="grey10")+
geom_tippoint(color="#6bc72b",fill="#6bc72b",
alpha=0.4, size=3,shape=21)
p2

后面的教程参数调整，按着教程即可如何绘制添加分类色块的进化树？

2.6.2 MEGA制作进化树

此部分内容来自：TBtools | 基因家族分析 (进化树、Motifs、结构域)输入数据为目标基因家族的蛋白质序列。

先进行多序列比对，用MUSCLE默认参数。图片将比对好的结果保存为.meg格式。重新打开比对后的文件，构建进化树，使用最大似然法，根据需要选择建树方法。再构建之前可以进行模型的预测，这里节省时间直接使用默认参数。

现在就构建好了一棵进化树，导出为.nwk格式。接下来最后一步就是在TBtools中展示所有结果。

2.7 使用Figtree绘制进化树

在2.6和2.7小节中，我们讲述了使用ggtree和MEAG绘制进化树，这些软件都是比较常用的。在这次作图过程中，自己的无意间也查询到使用Figtree可视化工具绘制进化树。主要是看到这张图，平时自己看到的图都是矩阵类型或是圆形，类似这个半圆看着是比较好看。Figtree网址：http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/软件下载可以到GitHub中下载：https://github.com/rambaut/figtree/releases下载后无需安装，即可使用(根据自己的版本调整)。将FigTree v1.4.4快捷键发送到桌面即可

对于Figtree软件的使用，全网依旧是很一定数量的教程，大家可以自行进行查找，或观看帮助文档。

2.7.1 Figtree绘制进化树基础图形

打开Figtree界面是比较简单，这个软件的获得的图形的类型也是相对比较少，只适合小众类型的进化树绘制。对于很复杂类型进化树还是不推荐使用Figtree绘制。

点击File–Open,导入数据
获得进化树
调整。全部参数可以在左侧调整即可。包括，大小、间距、距离参数等。以上参数，仅仅只是必要调整的参数，具体看自己的分析进行调整即可，无固定模式。

2.7.2 Figtree绘图的模式

我在前面说过Figtree绘制进化树的图类型很少，只有三种大类型。具体如下所示。

一般的聚类类型
圆形circular

2.7.3 Figtree绘制进化树美化图形

如何进行美化，是我们一直在追求的方向。在进化树中分支的上色是必须的，在Figtree中依旧可以做。「注意：我们这里只是简单的说明如何上色，具体操作自己进行。」最终图形可以获得如下图所示。

2.7.4 Figtree导出图形

调整好图形参数，如何导出图形呢？操作如下所示。File–Export JPEG/PNG/PDF.....，导出适合的的图形格式即可，但是建议导出的矢量图。后期AI进行调整。（通过上面导出图形，我们可以看到图形的颜色长度是不同的，这个问题要如何解决，暂时没有找到好的方法。在ggtree绘制中自己也遇到这里的问题。如果在的图形软件中无法解决，只能通过后期解决。）

2.7.4 重新文章中图形

那么如何绘制类似的图形呢？根据前期的参数，只需要进一步优化即可。2. 主图（1）将图形性状选择圆形（2）调整Root Angle和Angle Rangle调整到适合的形状。2. 分类附图在这个图中，我个人将其进化树分为进化树分类附图。这个图也是使用的Figtree进行绘制。具体操作如下所示。

选择分类图形
调整参数
树枝的宽度可以宽1-2个size
调整自己喜欢的Trabsform Branches
继续调整

—

「注意：」进化树的分支，主图和附图要一致。为了进一步确定明确两个图的一致性，建议直接在附图中，对分支进行填充颜色。操作与上述一致。

2.7.5 AI合并美化

打开AI
新建图形
导入进化树图形
Ctrl + R打开AI中的标尺、拖出x轴或Y轴参考线
调整半圆进化树，做到“横平竖直”
Ctrl + A全选，选择图形，Ctrl + C进行复制，或直接进行拖拽到新建图形中。
调整适合的图形大小，调整时，一直按住shuft，避免图形横纵大小改变。
建议，在图形中如有新的图形产出，建议每个新的图形都新建立一个图层，利于后期的修改。
随后就进行进化的调整，我们在这里，需要对AI有一定的基础知识，才可以。比如，如何随意修改图形的形状，类似图例所示。这里操作很繁琐，具体操作自己进行。
导入进化树分支
如何线条太细，可以进行调整适合粗细。
分支添加颜色

新建图形
选择椭圆工具
绘制椭圆，调整适合的分支位置和的添加分支颜色
适当的调整颜色
依次绘绘制即可
字体调整（如果在图形中梯子较小，也可以在AI中调整）使用选择工具，选择调整字体，直接进行修改即可。
调整图形大小
最终出图
也可以直接间监矩形进化树进行进行合并，相比育德圆形或半圆，调整颜色柱就很容易，直接拉成一样长度即可。—「细节自己调整。」

2.8 目的基因结构可视化

需要文件:

目的基因注释文件（GFF or GTF）
进化树文件（可选）

2.8.1 使用ID和基因组注释文件绘制

使用TBtools直接操作，依次点击：Gene Structure View结果如图所示：

2.8.2 提取目的基因的注释文件（推荐）

我们会发现，输入ID处也是可以输入进化树文件信息。因此，我们推荐直接提取获得目的基因的注释文件信息，单独使用GTF文件信息或是GFF信息进行绘制。

获得GFF注释信息
使用已有的目的基因的ID与基因组注释文件进行匹配获得。

cat Araport11_GTF_genes_transposons.current.gtf | grep -wf TAR11.test.id > TAR11.test.gtf

$ cat Araport11_GTF_genes_transposons.current.gtf | grep -wf TAR11.test.id | head 
Chr1	Araport11	mRNA	18935301	18937665	.	+	.	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18935380	18935673	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18935743	18935796	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18935908	18935982	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18936083	18936205	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18936278	18936469	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18936552	18936635	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18936723	18936815	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18936903	18936956	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";
Chr1	Araport11	CDS	18937039	18937118	.	+	0	transcript_id "AT1G51110.1"; gene_id "AT1G51110";

进化树获得
同上的方法获得
MEMExml or MAST.xml文件
同上
绘图
依次提交相关的文件即可

2.9 进化树、Motifs、结构域、基因结构合图绘制

以上的操作，都可以获得单张图形，那么如何多图绘制在一起呢？TBtools也提供了相关的教程,TBtools | 多图合一至强版教程！进化树 + Motifs + 结构域 + 启动子 + 基因结构 + ….，我们可以根据此教程进操作。具体如下：获得结果（来自CJ的教程）：

2.10 图形美化

到这里，我们的整张图形就可以获得。但是，只是这样的话，我觉得自己的这个教程就没有意义。我前面说过，我的这个教程重点是图形美化。自己是更喜欢，TBtools单张出图的类型，然后进行AI或PS美化的。软件默认的颜色，我自己不是很喜欢，但是也可以自己调整，也是很方便的哦。

2.10.1 TBtools图形颜色的调整

我们这里只是随意进行调整，图形无任何意义。

步骤一、点击图形中的方块、右键
调整色块3、选择先要的色块、点击Selecteed4、更改成功
但是你会大发现，图中所有一样的颜色色块都会改变。

类似的功能、自己逐渐去摸索。

2.10.2 单张出图

如果上面的方式没有很好实现自己想要的效果。那么，我们就只能单张出图、后面再进行合并。

「注意：在绘图时，我们的要提前想好自己的文章或这张图的颜色设置，以及图形的色调是属于什么类型的。理论上，一整篇文章图形色调和类型要保持一致。」

如果，在后期的调整中。图形颜色需要重新调整，我们可使用AI进行调整或是重新绘制，少量还是比较方便，但是图形又大有多，重画是很奔溃的事情。

三、IA图形美化

美化，我罗列出单个章节进行讲解。表明，是很重要的。以及，图形的美化，需要不断学习和模范大牌期刊的图形类型，以及自己要时刻进行总结和创新。对于创新，这个就比较玄学，每个人的审美不同，逻辑不同，关注点不同…….导致最终看到的点也不同。因此，我们在不是很离谱的创作中，结合自己的审美进行美化即可。「我们要坚信：审美。首先要符合自己，其次，再考虑别人。」只有自己先认同，你才有可能让其他人也认同！

3.1 使用工具

1.「推荐使用的工具」：AI、PS

如果不知道类似软件的，自己百度。

如何安装

有钱人：购买正版
穷人（和我一样）：薅羊毛，使用破解版

如何获取安装包

在本公众号中回复关键词获得。

PS安装包关键词：PS
AI安装包关键词：AI

或是你自己寻找相关版本的安装包即可。

「提示：」请自己输入正确的关键词（每次看到有些同学们的关键词，真的很无语……）

3.2 实际操作

打开AI，新建图层A4
导入进化树，适当调整进化树的宽度和字体大小
依次导入的目的基因的motif、基因结构域等图形。并依次按进化树基因名进行排序即可。
为后期的图形的整齐性，我们使用参考线进行对齐，便于后期的调整。「注意：这里看到我们的motif的图形颜色很难看，这就是前期没有考虑颜色的结果。因此，我一直强调，文章图形颜色统一的重要性，图形颜色搭配合理，你的论文已经成功1/3了。」换一种颜色就感觉好多了呀。
添加基因结构图添加图形的操作都是一样的，不做多赘述。
如何美化
对于美化，每个人的要求不一致，只要符合你的审美即可。我们在这里就直接添加渐变色。
新建一个图层
新建图层置于最底层。
选择图形工具
利用进化树的分支，将其进行分类
填充颜色（根据自己的喜好）
更改透明图
渐变色

不透明度：60
中间位置：10-50%
结合实际情况调节。

最后图形图形很多细节需要自己耐心调节，这里只是做示范，相对比较粗糙。

四、多物种共线分析

共线分析依旧是使用TBtools，哈哈哈哈，做基因家族TBtools可以帮你完成80%的生信分析。毫不夸张!!!!!
TBtools共线分析的教程很多，我们以零基础多物种间共线性分析教程作为参考（也不是作为参考了，是直接按他的步骤进行操作）。其他参考教程：全基因组共线性分析、无限个！物种共线性分析结果可视化、任何人！一键完成物种间的共线性分析与可视化。

4.1 需要文件

参考基因组fa文件
注释文件GFF or GTF

TBtools可以对无限个作物进行共线分析，牛！！！

4.2 染色体统一命名

在这个教程中，有这样的一个步骤，如果你需要，你就进行操作。

gtf文件进行ID prefix

3. fa文件进行ID prefix

4.3 实操

打开one step MCScanx小程序
输入两个作物的文件信息
点击开始Start
如果是多个作物，那么依次进行两两比较。比如：共线结果是以这样的顺序：Tomato-LA-Arabidopsis

比对顺序：

Tomato-LA
LA-Arabidopsis

比对结果GFF文件合并

打开Text Merge for MCScanX程序合并多个的MCScanX的结果文件中的GFF文件拖拽文件

6.比对结果ChrLayout.tab.xls文件合并7. 比对结果geneLinks.tab.xls文件合并同上操作！8. 合并文件
最终获得以下3个文件，用于绘制图形。9. 要在共线中显色的基因ID

Solyc03g062790.3.1
Solyc10g018590.2.1
Solyc01g104320.4.1
Solyc03g083420.4.1
AT4G22240.1
AT2G35490.1
AT1G51110.1
AT5G53450.3
........

绘图。打开Multiple synteny plot输入参数输出图形

注意，在输出图形中，我们可以看到作物染色体位置是有改变的。那么，如何更改呢？回答：直接更改Chr文件即可。更改这里的顺序即可！

五、同源目标基因元件预测

目标基因的元件预测，我们这里主要介绍使用两个网站进行。

5.1 提取目标基因上游2000bp

参考教程顺式作用元件预测和新的可视化方式、植物启动子-顺式作用元件-批量提取-预测-可视化分析，同样是使用TBtools操作。

需要文件

作物参考基因组fa文件
注释文件GFF or GTF
目标基因ID

直接使用TBtools中的Gtf /Gff3 Sequences Extractor获得每个基因的fa序列输出文件点击Initalize，选择CDS选择上游2000bp的fa序列
目标基因的fa序列，打开Fasta Extract or Filter (Quick)输出结果文件：
查看信息是否正确，打开Fasta Stats
转换序列（全部为大写），打开Sequence Manipulate (Rev&Comp

5.2 提交预测网址进行顺式作用预测

预测，这里使用两个网站进行预测，分别是PlantCare和PLCAE。

5.2.1 使用Plantcare进行预测

网址：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/

上传序列后，Plant可以提供你自己的邮箱，运行结束后，结果直接发送到你的邮箱中。
邮箱中获得结果，根据你的序列多少，10分钟以上吧！
结果
使用execl打开后

1. 基因ID；
2. 顺式作用元件名称；
3. 顺式作用元件序列；
4. 顺式作用元件的起始位置；
5. 顺式作用元件的长度；
6. 顺式作用元件所在的链的方向；
7. 物种名；
8. 顺式作用元件所在的功能分类；

删除某些不需要的结果：「需要删除：」

1. 剔除第2列为空的行
2. 剔除第2列为unnamed的行
3. 最后一列，无功能作用的

具体删除的数据，根据自己的分析来做。最后，可以删除掉1000行以内

—

来自顺式作用元件预测和新的可视化方式，这个意见有重要的参考意义。如果不合并，导致元件的作用太多，绘制出的图形颜色太杂，且不好看。5. 绘图绘图前还需要准备基因的长度文件输入数据，设置参数结果：在TBtools中也可以输入进化树文件。

我们这里也可以使用的起那么AI中的呢进化树进行模板进行美化。

5.2.2 PLACE进行预测

网址:https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace

缺点：PLACE一次最大只能输入20条基因序列，有一定的限制性。获得结果为网页版，如要整理，只能手动整理或使用脚本进行整理。
优点：速度快！

获得结果每个基因为单独的，需要自己整理。

只给元件名称、开始位置、序列、功能（SITE，需要点击进去才可以看到）
整理，单独粘贴复制到execl中，并使用脚本进行整理。

选择哪个网站进行预测，取决于自己。只要结果符合我们自己的预期结果即可！！！

5.2.3 热图可视化

输入数据格式如下（可以根据自己的情况筛选）：脚本：

install.packages('tidyverse')
intall.packages('RColorBrewer')

# 加载包
library(tidyverse)
library(RColorBrewer)

# 1.读取数据
df <- read_tsv('data.txt', col_names = F) %>% select(1,2)

# 2.整理数据
tidy <- df %>% 
  group_by(X1, X2) %>% 
  summarise(number = n()) %>%
  arrange(desc(number))

# 3.查看数量分布，确定配色个数
summary(tidy$number)
# 最大值为9，所以下面的代码 hcl.colors(9, "RdYlGn")中为9

# 4.画图
  ggplot(tidy, aes(x = X2, y = X1, fill = number)) +
  geom_tile(color = 'black') +
  geom_text(aes(label = number),col='black',cex = 1.5) +
  scale_fill_gradientn(colors = rev(hcl.colors(9, "RdYlGn"))) +
  scale_x_discrete(position = "top")+
  theme_bw() +
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 90, hjust = 0),
        axis.title = element_blank(),
        axis.text = element_text(size = 7, color = 'black'))

# 通过修改 scale_fill_gradientn参数给每一个值指定颜色
cc <- c('#d9d9d9', '#f7fcb9', '#d9f0a3', '#addd8e', '#78c679', '#feb24c', '#fd8d3c', '#fc4e2a', '#b10026')

ggplot(tidy, aes(x = X2, y = X1, fill = number)) +
  geom_tile(color = 'black') +
  geom_text(aes(label = number),col='black',cex = 2.5) +
  scale_fill_gradientn(colors = cc) +
  scale_x_discrete(position = "top")+
  theme_bw() +
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 90, hjust = 0),
        axis.title = element_blank(),
        axis.text = element_text(size = 7, color = 'black'))

5.2.4 美化

基于AI进行美化，方法同上

六 ENDING

说实话，基因家族的文章分析确实消耗的时间和精力不算是很多。生信部分就差不多这些吧！再加上一些组学的数据来验证即可。除了生信的部分，剩余就是实验来验证，将两者进行结合，好一点的文章也可以发。我自己前面没有接触过基因家族的分析，因此，本次就是现学现做，做的还是比较简单。

本次来接触基因家族的分析，感触最深的就是，TBtools真的很强大。基因家族的分析、画图都可以使用它来完成。不得了啊，真的是将做生信的门槛一降再降，点赞点赞。

本期内容是自己的做了一个整理，算是“教程搬运工”，也是自己在做分析后做的总结。自己不知道，这次分析后，多久以后还能涉及基因家族的分析。总结总结！！

但是，说实话！这个总结也花费自己很长的时间，如果你想获得这个教程的文本文档，可以“喜欢点赞，支持”，我在后台看到后会第一时间将文档链接发给你！！

「话说公众号需要标星，这样公众号的内容你才不会错过。那么，我们也动手标一下吧。」

「小杜的生信筆記」，主要发表或收录生物信息学的教程，以及基于R的分析和可视化（包括数据分析，图形绘制等）；分享感兴趣的文献和学习资料!!

基于TBtools做基因家族分析 | 生信部分

基于TBtools做基因家族分析 | 生信部分

一、 写在前面

一，在Pfam数据中获得基因家族

二、同源序列检索预测

2.1 HMMER同源结构域搜索

2.1.1 Hmmer的安装

2.1.2 使用hmmbuild构建.hmm文件

2.2 提取目的基因序列

2.3 使用TBtools提取目的基因

2.3.1 TBtools软件的下载

2.3.2 提取序列

2.4.1 使用MEME进行motif预测

2.4.2 motif可视化

2.4.3 motif的分析

2.5 基因家族保守结构域分析

2.6 进化树分析

2.6.1 iqtree+ggtree绘制进化树教程

2.6.2 MEGA制作进化树

2.7 使用Figtree绘制进化树

2.7.1 Figtree绘制进化树基础图形

2.7.2 Figtree绘图的模式

2.7.3 Figtree绘制进化树美化图形

2.7.4 Figtree导出图形

2.7.4 重新文章中图形

2.7.5 AI合并美化

2.8 目的基因结构可视化

2.8.1 使用ID和基因组注释文件绘制

2.8.2 提取目的基因的注释文件（推荐）

2.9 进化树、Motifs、结构域、基因结构合图绘制

2.10 图形美化

2.10.1 TBtools图形颜色的调整

2.10.2 单张出图

三、IA图形美化

3.1 使用工具

3.2 实际操作

四、多物种共线分析

4.1 需要文件

4.2 染色体统一命名

4.3 实操

五、同源目标基因元件预测

5.1 提取目标基因上游2000bp

5.2 提交预测网址进行顺式作用预测

5.2.1 使用Plantcare进行预测

5.2.2 PLACE进行预测

5.2.3 热图可视化

5.2.4 美化

六 ENDING

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一、写在前面