2024-06-16

10×genomics单细胞测序分析（一）环境搭建与Cell Ranger数据处理

大海哥生信果 2023-09-23 19:02:26

转自公众号：生信滩
http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzkzMzUwODcwMg==&mid=2247486780&idx=1&sn=ada20543f11b7385442794e9760fd9e2

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10×genomics因其分选细胞效果好，通量高等优点已成为主流的单细胞测序平台。

大海哥上期对它的原理进行了介绍，感兴趣的小伙伴可以去看。这期大海哥将介绍10×genomics单细胞测序分析环境的搭建与用10×平台官方出的数据处理流程Cell Ranger进行数据处理与count表达矩阵的生成。

通常这是单细胞分析的整个流程。

与许多组学分析一样，先将FASTQ文件比对，转换为二进制的BAM文件，然后进行基因表达计数。拿到表达矩阵后才能进行下一步的分析。

今天大海哥带大家完成流程的搭建与上游的的数据处理。就是这张图上面三个步骤。

一、准备工作

（一）软件安装

1.CellRanger

Cell Ranger是10×genomics官方出的数据处理分析工具，它的适配度好，功能强大，操作简单等优点，成为了单细胞测序数据分析的必备工具。

在获得单细胞的测序数据后，使用Cell Ranger来进行数据的处理与分析的工作流程。

What is Cell Ranger? -Software -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support

上面是10×genomics测序平台Cell Ranger主页链接，详细介绍了Cell Ranger是什么与怎么用。

下载需要填写信息完成注册。

复制下载链接到linux命令行，运行并下载

#随后解压缩下载的软件包

tar -zxvf cellranger-7.1.0.tar.gz

在命令行敲一下，ok，软件安装好了。

2.Loupe Browser

Loupe Browser是一个桌面应用程序，提供交互式可视化分析来自不同 10x 基因组学解决方案的数据的功能。它能轻松查询 10x 基因组学数据的不同视图快速深入了解数据。

下载仍然需要填写一次信息。填写好信息后便可以下载。

在windows系统下打开安装包，进行安装即可。

这是应用的界面

3.bcl2fastq

是illumina平台内置的一个软件，Cell Ranger没有集成这个软件，我们需要自己去下载。有了这个软件之后，Cell Ranger可以完成从bcl测序文件，到最后结果生成，一条龙式地完成。

bcl2fastqandbcl2fastq2Conversion Software Downloads (illumina.com.cn)

bcl2fastq的网站

同样需要注册填写信息，就可以进一步安装了

https://support.illumina.com.cn/content/dam/illumina-support/documents/downloads/software/bcl2fastq/bcl2fastq2-v2-18-0-12-tar.zip

这里贴上下载的地址

unzip bcl2fastq/bcl2fastq2-v2-18-0-12-tar.ziptar -zxvf bcl2fastq/bcl2fastq2-v2-18-0-12-tar.gz

#编译软件

cd bcl2fastq2chmod ugo+x src/configure chmod ugo+x src/cmake/bootstrap/installCmake.shmkdir bincd bin../src/configure --prefix=${PWD}/binmakemake install

4.创建conda环境安装软件

#安装mambaconda install -y mamba#创建虚拟环境conda crate -n -y singlecell#激活环境conda activate singlecell#下载软件mamba install -y fastqcmamba install -u multiqcmamba install -y fastpmamba install -y starmamba install -y bioconductor-singlermamba install -y samtoolsmamba install -y featurecountsmamba install -y r-seuratmamba install -y umi_tools

二、数据下载

1.参考序列下载

#人基因组wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
#小鼠基因组wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
#人和小鼠混合wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-and-mm10-2020-A.tar.gz
#Sample Index Set Sequenceswget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/chromium-shared-sample-indexes-plate.csvwget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/chromium-single-cell-sample-indexes-plate-v1.csvwget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/gemcode-single-cell-sample-indexes-plate.csv

2.练习数据下载

#pbmc 1k数据wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_fastqs.tar
1000个单细胞的测序数据

三、使用cellranger分析单细胞数据

（一）Basecalling

1.将测序原始数据bcl文件转换为fastq文件

#案例数据，illuminca测序原始数据
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv
tar -zxvf cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz

这是这个原始测序数据所包含的内容，数据在这个Data目录下面。

非常简单，只要输入文件，及输出的文件夹就行了。因为数据很小，很快就运行好了。

生成的fastq就在这个文件夹里。

Test_sample就是最终的结果。文件名会根据simple文件的名称命名。

打开第一个看一下，其为Index序列。

Read1为barcod+UMI

Read2是真正的我们想要的测序序列。

该部分为演示如何将bcl转化为fastq。

2.质控

接下来我们对练习数据进行处理，这里我们打开案例的数据。使用通配符*匹配所有fastq的read2。然后进行质控。

#对read2 进行质控ll pbmc_1k_v3_fastqs/pbmc_1k_v3*_R2_001.fastq.gzfastqc -t 12 -f fastq -o qc1 pbmc_1k_v3_fastqs/pbmc_1k_v3*_R2_001.fastq.gz

质控结果，显示测序数据质量较好。

10×genomics的测序数据通常质量较好，所以绝大部分不用进行质控以及过滤。

实在过滤的话呢，由于read1和read2不一样，前者是barcode，后者是测序数据，对测序数据过滤掉以后，二者索引不匹配，引起操作麻烦。

（二）生成表达矩阵

Cellranger count的选项参数，该软件主打的就是一个简单方便，用起来简单绝对是个优点。

输入前面三个参数就可以工作了。

#计算count 矩阵，pbmc 1000个细胞，等号之间不要有空格cellranger count --id=run_count_1kpbmcs --fastqs=pbmc_1k_v3_fastqs --sample=pbmc_1k_v3     --transcriptome=refdata-gex-GRCh38-2020-A/     --localcores=12 --localmem=32