你绝对能拿下的IF 7+的新思路！孟德尔与药靶研究新结合！还有药理学验证神助攻！四川大学陈永平团队玩转孟德尔！快来！

孟德尔随机化(MR)应用遗传变异(工具变量，IVs)来研究因果关系，比传统的流行病学方法具有更少的偏倚，因此在近几年研究十分火热。本文也是从孟德尔随机化出发，再加上药理学验证，一举拿下9分＋高水平论文，一起来看看吧~  

1. 使用孟德尔随机化 (MR) 方法研究ALS：MR是一种利用遗传变异作为工具变量来评估因果关系的方法。本研究首次使用MR方法来研究ALS（肌萎缩侧索硬化症）的发病机制和潜在药物靶点。     

2. 结合eQTL和药物靶点数据进行筛选：研究人员将显著的cis-eQTL（表达量遗传调控位点）和可药物靶点基因列表进行重叠分析，筛选出与ALS相关的潜在药物靶点基因。   

3. 验证结果的可靠性：为了增加结果的可靠性，研究人员使用不同的SNP选择参数和额外的血液、脑部和脊髓数据库进行验证，确认了TBK1、TNFSF12、RESP18和GPX3在ALS中的作用。      

4. 提供潜在的药物靶点列表：研究人员总结了潜在的可药物靶点基因列表，并根据这些基因的MR结果绘制了图表，为进一步的研究和药物开发提供了候选靶点。          

总之，这篇文章通过创新的研究方法和筛选策略，揭示了与ALS相关的潜在药物靶点，并为进一步的研究和治疗提供了重要的线索。（各位小伙伴们，发表到MR文章可谓是打开了全新的机遇之门啊！MR如今已经“火爆全场”想要先人一步？那就必须及早加入战局，无论是创新思路还是生物信息学分析，小途都能帮你登顶，期待着你的高水平论文！）  

l题目：肠道微生物群对败血症和败血症相关死亡的因果影响:来自全基因组孟德尔随机化、单细胞RNA、整体RNA测序和网络药理学的见解

l杂志：Journal of Translational Medicine

l影响因子：IF=7.4

l发表时间：2024年1月

研究背景

这篇文章的研究背景是关于肌萎缩侧索硬化（ALS）的治疗。ALS是一种神经退行性疾病，目前尚无有效的治疗方法。研究人员通过使用MR方法，探索与ALS相关的潜在治疗靶点。通过分析大规模基因组数据和临床数据，确定了一个与ALS风险相关的基因TBK1，并进一步研究了该基因的功能和调控机制。这项研究为ALS的治疗提供了新的方向和潜在的药物靶点，希望解决靶点未知机理不明晰的问题。

          

数据来源

这篇文章的数据来源主要是通过实验和分析获得的。DNA位置均基于人类参考基因组构建hg19 (GRCh37)，脑组织的顺式eQTL数据由基因型和基因表达数据进行，来自1387个个体，包括679个健康对照、497个精神分裂症、172个双相情感障碍、31个自闭症谱系障碍和8个情感障碍患者。实验中使用了多种细胞系和试剂，如NSC-34细胞、THP-1细胞、Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）、RPMI-1640培养基等。通过Western blotting和RT-qPCR等技术对蛋白质表达水平进行了评估。此外，还使用了细胞毒性测试（CCK-8 assay）来评估细胞的毒性    

研究思路

这篇研究的主要思路是通过应用孟德尔随机化 (MR)方法，结合遗传变异和基因表达数据，来识别与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的潜在可药物靶点。研究首先收集了与ALS相关的基因表达定量性状位点（cis-eQTL）数据，并将其作为代理变量来分析核苷酸变异与基因表达之间的关系。然后，利用ALS的基因关联研究（GWAS）结果，通过MR分析，筛选出与ALS风险相关的潜在可药物靶点。接下来，通过进一步的共定位分析，确定了与ALS风险更强相关的靶点基因，包括TBK1、TNFSF12、RESP18和GPX3。最后，研究通过一系列的筛选标准，识别出与这些靶点基因相关的已有药物，如R788和AMX，并在ALS细胞模型中验证了这些药物的治疗潜力。整个研究的目标是为ALS的药物开发提供潜在的靶点和药物候选，并为进一步的临床应用提供基础。

              

主要结果

  ·基因表达与ALS预后的MR分析

将显著顺式- eqtl与可用药基因符号列表重叠后，作者得到2347个血源性基因和1679个脑源性可用药基因(图1)。根据仪器变异的选择标准，在发现分析中，共有1125个血药基因的1601个snp和648个脑药基因的693个snp作为iv进行进一步的MR分析。通过在GTEx中分析因果基因对应的IV是否对其他基因的表达有影响，作者没有观察到TBK1的IV对其他基因的影响。然而，与TNFSF12相关的IV被发现影响多个基因的表达，包括ATP1B2、CHRNB1、EIF4A1、FGF11、POLR2A、SAT2、SENP3、TNFSF13和ZBTB4。此外，作者还发现GPX3的IV能够影响TNIP1的表达，而与RESP18相关的IV能够影响AC053503.12、AC053503.4、GLB1L、PTPRN、ZFAND2B的表达。此外，MR分析结果显示含有2个以上SNPs的基因IVs仅存在于血液中，作者对这些基因进行了敏感性分析。敏感性分析结果显示，除STK32C、PXDN、PAM、CD93和SIRPB1外，所有snp大于2的基因均通过MR-Egger和加权中位数法检测(P < 0.05)。

图 1潜在药物基因的MR和共定位结果    

          

·发现重新利用的药物

作者获得了5种作用于3个als相关基因靶点的药物，分别是TBK1、TNFSF12和GPX3(表1)。根据作者的纳入标准，候选药物分为3个层次:谷胱甘肽是一种参与多种生理和病理状态的三肽。虽然谷胱甘肽可能拮抗GPX3缺乏症引起的神经氧化应激反应，但由于其广谱作用，作者将其排除在初级选择(一级)之外。BIIB023和RG7212都是抗tnfsf12抗体，可能调节神经元和肿瘤组织的炎症过程，目前正在进行临床研究(BIIB023的标识号NCT01407406和RG7212的标识号NCT01383733)。由于安全性和有效性不确定，这两种生物制剂未能通过二级筛选。AMX是fda批准的TBK1抑制剂，而R788是fda批准的SYK抑制剂，与TBK1具有高亲和力。

          

图 2 3个ALS可药物基因靶点和5个现有药物被确定为药物再利用应用

          

·AMX和R788作为TBK1抑制剂的鉴定

R788在体内可快速转化为R406，而其在细胞实验中的代谢过程尚不清楚。因此，作者进行了单独的分子对接模拟，以研究TBK1与每种化学物质之间的相互作用。作者的数据显示，这两种化学物质都适合TBK1激酶结构域，其中自由能分别为- 9.4 kcal/mol和- 8.9 kcal/mol(图3)。值得注意的是，R406与TBK1的6个氨基酸残基形成疏水相互作用，其中5个(Ser93、Leu15、Gly139、Asn140、Asp157)被发现位于带注释的atp结合位点或atp袋内(图3E)。另一方面，预测的R788-TBK1相互作用显示出氢键(与Ser93、Thr96、Leu15、Gly18、Ala21、Asp157、Thr156、Lys137)、疏水相互作用(与Lys137、Asp157)、卤素键(与Thr156)和盐桥(与Lys38)。其中，6个氨基酸(Ser93、Leu15、Gly18、Ala21、Lys38、Asp157)位于同一基序中(图3)。这些发现表明TBK1与R788或R406之间具有高度的相互作用亲和性，尽管在CETSA实验中没有发现TBK1在R788后的热稳定性发生明显变化。         

图 3SYK与TBK1激酶结构域氨基酸序列比较

          

·R788和AMX抑制MSA-2诱导的cGAS/STING激活

已有研究表明，AMX与TBK1的铰链区结合，在介导TBK1和IKKε的酶活性中发挥关键作用。作者采用细胞热移测定(CETSA)来研究这两种化学物质对TBK1热稳定性的影响。结果显示，与对照相比，在37-60°C的温度范围内，AMX对NSC-34细胞裂解物中TBK1热稳定性的影响表现出中等差异。作为一种SYK抑制剂，R788及其活性化合物R406已被证实与一系列蛋白激酶靶点相互作用，包括TBK1也与SYK的结合亲和力(Kd = ~ 19 nM)相当。已发表的共晶结构表明，R406嵌入在SYK激酶结构域内，占据atp结合口袋。它与铰链残基Ala451形成两个氢键，芳香CH-O与Glu449主羰基相互作用。值得注意的是，上述所有药物相互作用残基在TBK1的ATP口袋和ATP结合区域中存在的关键氨基酸具有相似性。        

图 4R406和SYK通过共晶结构(PDB: 3FQS)的相互作用

          

·R788和AMX抑制ALS相关毒性蛋白介导的cGAS/STING信号传导

作者观察到质粒转染本身由于对细胞溶质中发生的质粒DNA的基础cGAS/STING应答而触发TBK 1磷酸化。此外，在用SOD 1和TDP 43相关质粒转染的组中也观察到p-TBK 1的进一步增加，这证实了ALS毒性蛋白对p-TBK 1的诱导（图5）。此外，作者应用强力霉素诱导系统在NSC-34细胞内表达TDP 43和Q331 K突变质粒。结果显示，在该系统中，R788显著抑制p-TBK 1和p-IRF 3。作者还观察到AMX处理组中p-p65和p-IRF 3降低，其中p-TBK 1是完整的（图5 ）。此外，p65、IRF 3和IKKε的总蛋白表达水平保持不变。这一发现与报告的抑制TBK 1和IKKε的双重特异性一致。此外，RT-qPCR数据表明，R788和AMX抑制作者在过度表达TDP-43 WT/Q331 K或SOD 1 WT/G93 A的NSC-34细胞中测试的最下游cGAS/STING效应物的表达。仅在TDP 43 Q331 K突变体中观察到对AMX的TNFA表达的明显抑制，这可能是由于其他转染子中不显著的基因表达差异。至于另一种主要ALS相关基因的细胞模型，qPCR结果显示，R788抑制过表达C9 orf 72 GA 50/PA 50的NSC-34细胞中IFNB、TNFA和IL-6的表达，而AMX仅抑制IFNB的表达。为此，作者的研究结果表明R788和AMX对某些ALS相关神经炎症亚型具有潜在的保护作用。   

图 5 R788和AMX抑制由TDP-43/SOD 1诱导的cGAS/STING依赖性促炎信号传导

          

·ALS既往可用药基因的表型全MR分析

由于大多数药物通过血液循环发挥作用，作者评估了血液中的TBK1靶向药物对其他适应症是否有有益或有害的影响。在英国生物库（SAIGE v.0.29）中对783种非ALS疾病或性状进行了更广泛的MR筛查，结果显示使用Wald比率方法未发现显著相关性（FDR < 0.05），表明这些药物是安全的或副作用很少。

   

图 6R788/AMX和cGAS-STING途径之间的信号相互作用的示意图

          

文章小结

  本文的研究旨在通过孟德尔随机化分析，探索与肌萎缩性侧索硬化症 (ALS) 相关的可药物靶点。研究结果表明，在血液和大脑中，有一些基因表达与ALS风险相关。具体而言，在血液中，TNFSF13和CD68的表达与降低ALS风险相关，而TNFSF12、TBK1和GPX3的表达与增加ALS风险相关。在大脑中，RESP18的表达与增加ALS风险相关，而GDF9、PTPRN和GPX3的表达与降低ALS风险相关。而这些结果的产生均通过孟德尔随机化的方法得出，由此可见孟德尔随机化针对多因素分析相关特征的影响十分靠谱！试想换个主题，同个思路，是不是又有一篇高分研究因果关系的论文出炉呢？（小途一直在不断提供最新的孟德尔随机化思路，为您带来前沿科研的启示！如果您对这些思路感兴趣，并希望深入探讨或获取更多创新性想法，欢迎扫描下方的二维码，与小途联系。我们期待与您一起探索科学的边界，们携手并进，共同追求问鼎高水平论文！）    

小果还提供思路设计、定制生信分析、文献思路复现；有需要的小伙伴欢迎直接扫码咨询小果，竭诚为您的科研助力！

定制生信分析

服务器租赁

扫码咨询小果

往期回顾

01 ｜1024G存储的生信服务器，两人成团，1人免单！

02 ｜单个数据库用腻了？多数据库“组合拳”带你打开免疫浸润新思路！

03 ｜孟德尔随机化的准备工作，GWAS数据的网站下载方法

04 ｜跟着小果学复现-手把手带你拿下IF=46.9Nature 级别的主成分分析（PCA）图！！