2024-06-17

Buff叠满了！中医药+单细胞+铁死亡+非肿瘤疾病！！第四军医大学西京医院丁一团队中科院二区9.3分！助力中医药创造新辉煌！

馆长生信果 2024-04-26 19:00:29

转自公众号：生信图书馆
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进入新世纪以来，测序和组学技术得到了迅速发展。但是传统的测序技术反映的是一组细胞类型中所有信号的平均值，忽略了单个细胞类型的独特基因信息。与传统技术相比，单细胞测序可以更加精确地确定细胞数量和类型，深入到单个细胞层面，以更高的精度捕获单个细胞的生物信息，具有更高的准确性、可靠性、深度和效率。单细胞测序还可以对多种细胞同时作检测，发现它们在某些生理或病理状态下的相互影响及作用机制，更准确地反映出细胞中某一基因是否活跃及其活跃程度。

该篇文章采用更加准确和可靠的单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析方法，检测了MCAO小鼠中小胶质细胞和星形胶质细胞及其亚型中不同基因的表达和功能，证实KBA+Z-GS可以通过调节Spp1基因发挥在缺血性脑卒中的协同作用及其机制，为缺血性卒中提供有希望的治疗方法。馆长在看这篇文的时候就收获多多，想着要是我以后发文也必定用上！对于没有时间搞基础研究又着急发文毕业或者评职称的小伙伴，或是想用更新的分析算法工具提升文章level，快来和馆长聊聊，馆长一定有问必答哦！~

题目：单细胞转录组学揭示了11-酮-β-乳香酸和z -谷古酮对缺血性卒中的新协同作用机制

杂志：Pharmacol Res

影响因子：IF=9.3

发表时间：2023年5月23日

研究背景

中风是世界第三大死因，多数患者会引起不同程度的身体运动功能损伤等后遗症，导致暂时性或永久性运动障碍。中风也叫脑卒中。脑卒中又分为出血性卒中和缺血性卒中两种类型，缺血性卒中是最常见的病因，占总病例的80%。中医认为，缺血性中风属于血瘀证范畴，故而，具有活血化瘀功效的乳香和没药是中医临床常用于治疗缺血性脑卒中的药对。研究发现，乳香的活性成分11-酮-β-乳香酸(KBA)可以通过调节Nrf2/HO-1信号通路保护氧化应激引起的缺血性损伤；没药的主要活性成分z -古谷酮(Z-GS)可以通过抑制脑缺血后星形细胞和神经元介导的炎症反应改善大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠的神经损伤。但是关于KBA和Z-GS对缺血性脑卒中的协同作用及其机制研究很少。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)作为生命科学探索前沿的一种新兴技术，被广泛应用于癌症、神经生物学、胚胎发育、免疫学等领域。在本研究中，MCAO小鼠分别用KBA、Z-GS或其混合物处理。然后取缺血半暗区组织进行scRNA-seq分析，以揭示KBA与Z-GS的协同作用机制。

研究思路

本研究采用单细胞转录组学方法研究KBA和Z-GS对缺血性脑卒中的协同作用及其机制。该研究分为两部分：

(1)建立MCAO小鼠模型并给予相应药物后，首先对取出的脑组织进行神经功能评分与免疫荧光染色，再分离出小鼠脑单细胞制成悬液后进行scRNA-seq分析，接着使用10×Genomics Cell Ranger Single Cell 3.0.1 pipeline对scRNAseq数据进行处理，使用Seurat (version 2.3.1) R软件包通过PCA和t-SNE进行降维，然后确定细胞簇。

(2)通过技术获得小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞共同培养并进行短暂氧糖剥夺(OGD)，接着进行scRNA-seq分析与Western blotting。

主要结果

KBA+Z-GS处理的缺血半暗区共鉴定出14种细胞类型

图2A为单细胞测序流程示意图。作者利用转录组特征，在过滤掉低质量细胞后，对细胞类型进行分类，最终得到31872个高质量细胞，按照相似的基因表达模式分成25个细胞簇(图2B)。通过交叉参考每个簇特有的基因特征和CellMarker数据库中的细胞特征将细胞分类为14个原代细胞系(图2B和2C)。由图可知，MCAO组和给药组不同细胞类型的分布明显不同，这表明KBA和Z-GS处理对各种细胞类型的丰度具有调节作用(图2D和2F)。在这14种细胞类型中，小胶质细胞和星形胶质细胞所占比例最大，分别为33%和24%(图2E)。

KBA-Z-GS调节小胶质细胞亚型的细胞代谢和凋亡

为了进一步阐明小胶质细胞的多样性，将MCAO组、KBA组、Z-GS组、KBA＋Z-GS四组的10525个细胞进一步聚类，从而鉴定出11个不同的亚簇。然后，根据特定的标记基因表达，将它们鉴定为6种亚型 (图3A和3B)。MCAO和KBA-Z-GS治疗组在其亚型中表现出显著的差异(图3C)。细胞亚群比例图所示，KBA-Z-GS处理样品中Ttr^hi亚型细胞更丰富(图3D)。

接下来，采用GSVA分析每个小胶质细胞亚型在接受KBA-Z-GS处理时的反应(图3E)。通过分析tr^hi上调的DEGs和Rab7b^hi下调的DEGs，从中筛选出74个交叉基因(图3F)。功能分析表明，这74个差异基因与呼吸电子传递链、氧化磷酸化、ATP代谢过程等过程密切相关。此外，在tr^hi下调的DEGs和Rab7b^hi上调的DEGs中，筛选到223个与细胞死亡、细胞分化、细胞发育过程和凋亡过程相关的共有基因(图3G)。结果提示KBA-Z-GS可能通过调节细胞代谢和凋亡对Ttr^hi和Rab7b^hi亚型发挥保护作用。

KBA+Z-GS协同调节MCAO小鼠小胶质细胞炎症反应

为了进一步阐明KBA和Z-GS对小胶质细胞的协同保护作用，作者分析了KBA+Z-GS联合用药和单独用药的DEGs。与KBA组相比，KBA+Z-GS组有179个基因的表达升高，261个基因的表达降低(图6A)。Ptgds和Cxcl2分别为分别为上调和下调最多的DEGs (图6B)， KBA+Z-GS组与KBA组间DEGs的GSVA分析如图6C。

与Z-GS组相比，KBA+Z-GS组有57个基因表达升高，219个基因表达降低相关(图6D)。其中，Ptgds和Btg2分别为分别为上调和下调最多的DEGs (图6E)。KBA+Z-GS组与Z-GS组间DEGs的GSVA分析如图6 F。KBA和Z-GS联合或单独给药时小胶质细胞DEGs如图6 G，这67个基因参与 “TNF信号通路”、“核糖体”和“toll样受体信号通路”等的过程(图6 h)。Toll样受体信号通路相关基因NF-κB的表达如图6I。

为了更好地解释KBA和Z-GS的协同作用，作者建立了一种创新的药物-基因协同调控模式，将KBA+Z-GS调控的基因分为4类：增效-有益基因(EEBGs)、增效-有害基因(EEHGs)、减毒-有益基因(TRBGs)、减毒-有害基因(TRHGs)。根据该模式分别筛选59、117、0和2个DEGS(图6 J)。代表性DEGS为Spp1 的EEBGs、Rnf169的 EEHGs、Rps23 的 TRHGs (图6 K)。

KBA+Z-GS调节星形胶质细胞亚型的凋亡和神经系统发育

在KBA+Z-GS诱导后检测到的7718个星形胶质细胞中，从11个亚簇中鉴定出7个亚型 (图7B)。星形胶质细胞亚型在不同样品中的比例如图7C-7D所示。KBA组Slc7a1^hi和Ttr^hi亚型的星形胶质细胞比Z-GS组更丰富，而Apod^hi亚型的星形胶质细胞主要分布在MCAO组。

GSVA结果显示， KBA+Z-GS组Ttr^hi和St6galnac5^hi亚型具有不同的功能 (图7E)。Ttr^hi上调的DEGs和St6galnac5^hi下调的DEGs中的15个共有基因如图7 F。Ttr^hi下调的DEGs和St6galnac5^hi上调的DEGs的186个共有基因如图7G。从图可知，共有基因主要与神经元的发育和分化以及神经系统的产生和发生有关。上述数据表明，Ttr^hi可能是KBA+Z-GS组星形胶质细胞的一个关键亚型，KBA+Z-GS可以通过Ttr^hi抑制MCAO小鼠细胞凋亡并促进其神经系统发育发挥保护作用。

KBA+Z-GS协同调节MCAO小鼠星形胶质细胞铁死亡

接下来，作者分析了KBA和Z-GS联合用药与单独用药在星形胶质细胞中的DEGs。与KBA组相比，KBA+Z-GS组合上调基因358个，下调基因339个 (图10A)。Grm3和Mt2分别为上调与下调最多的DEGs (图10B)，根据GSVA分析，Grm3和Mt2 基因主要涉及“谷胱甘肽代谢”、“核糖体”和“蛋白酶体”途径(图10C)，这与小胶质细胞的结果相似。

与Z-GS组相比，KBA+Z-GS组合上调基因90个，下调基因66个 (图10D)。Serpina3n和Nebl分别为上调与下调最多的DEGs (图10E)。根据GSVA分析，Serpina3n和Nebl 主要涉及“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”、“氮代谢”和“核糖体”等途径(图10 F)，这与小胶质细胞的结果相似。但这些结果与KBA组和Z-GS组中小胶质细胞基因表达正好相反。提示KBA和Z-GS在星形胶质细胞和小胶质细胞之间具有协同作用。此外， G) KBA与Z-GS联合或单独给药时星形胶质细胞88个DEGs的维恩图如图10G，这些基因参与了铁死亡过程(图10H)。免疫荧光染色结果显示，MCAO组铁死亡生物标志物Fth1表达降低。然而，KAB和Z-GS的使用导致Fth1水平显著升高(图10I)。最后，作者还通过药物-基因协同调控模式确定了星形胶质细胞中KBA-Z-GS调控的4组的DEGs (图10 J)，代表基因为eebg的Spp1、eehg的Far1、trbg的Gpc5和trhg的Ubc(图10 K)。

Spp1是KBA-Z-GS协同保护MCAO的枢纽靶点

基于图4J、图8J、图5 G、9 G的共有基因的基础上，鉴定出9个与KBA+Z-GS协同作用相关的共有基因。最后，筛选出KBA+Z-GS协同保护MCAO的3个基因，包括Spp1、Mt2和Mt1(图11A)。Spp1在星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达分布如图11B所示。免疫荧光染色分析显示模型组Spp1表达下降。然而，经KBA或Z-GS处理后，星形胶质细胞和小胶质细胞中Spp1水平均显著升高，KBA和Z-GS的结合进一步促进了Spp1的表达，使其表达水平与对照组几乎相当(图11C)。共培养小胶质细胞和星形胶质细胞的结果也证实了KBA和Z-GS对Spp1的协同调节作用(图11D)。

文章小结

这篇文章逻辑清晰，层层递进，通过scRNA-seq证实了KBA+Z-GS在缺血性脑卒中的协同作用及其机制。KBA+Z-GS协同调节小胶质细胞和星形胶质细胞及其亚型中不同基因的表达和功能。创新的药物-基因协同调控模式帮助筛选了KBA和ZGS的多个靶基因，其中Spp1被确定为枢纽基因。通过精确的药物开发靶向Spp1可能为缺血性卒中提供有希望的治疗方法。这篇文章利用组学助攻中医药实验研究，丰富实验内容，缩短研究周期，将中药治疗作用和scRNA-seq分析进行了完美地有机结合，分析并不复杂，实验难度也不高，但两者结合的效果很不错，馆长真诚建议大家赶紧抄作业，换个中药和疾病下一篇发表高分组学分析文章的就是你！创新思路，复现的大好时机，馆长坐等你的联系哦~

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