2024-06-17

仅入门级分析就轻松拿下5分+！生信小白可复现！铁死亡+巨噬细胞极化+干湿结合，上海交大医学院新作！

小途生信果 2024-03-08 19:00:44

转自公众号：生信路
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没有经费做单细胞测序？没有时间做大量的实验？试试分析公开的测序数据集，再补充一点实验，完美拿下5-10分的SCI！肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和铁死亡是协调调控的，从而共同调节对肿瘤免疫疗法的反应。目前为止，铁死亡、巨噬细胞极化的热点你还没追上吗？不仅可以轻松发文，还是国自然中标的秘籍！

今天这篇文章从原发性和复发性胶质母细胞瘤的公开数据集中筛选出铁死亡相关基因中的风险基因，并研究了肿瘤中这些相关风险基因与浸润性M1/M2巨噬细胞谱的关系。采用qPCR和Western blot法以探讨相关风险基因在调节胶质母细胞瘤（GBM）铁死亡和巨噬细胞极化中的作用。

本文是一篇干湿结合的文章，涉及到单细胞RNA测序数据集的分析。利用公开的数据集筛选想要的结果，再补充一些实验，可谓是省时省力！该文思路值得借鉴，欢迎想复现的小伙伴联系小途！

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题目：铁死亡相关风险基因对胶质母细胞瘤巨噬细胞M1/M2极化及预后的影响

杂志：Frontiers in Cellular Neuroscience

影响因子：IF=5.3

发表时间：2024年1月

研究背景

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤类型，最有可能发生在45-65岁的成年人中。胶质母细胞瘤（GBM）是一种具有代表性的胶质瘤，占中枢神经系统（CNS）所有恶性肿瘤的49.1%。目前，神经胶质瘤的治疗包括手术切除、免疫治疗、放疗、化疗和新型分子靶向治疗。尽管在临床管理方面取得了进展，但恶性胶质瘤患者的预后仍然相对较差。因此，仍然迫切需要研究胶质瘤，尤其是GBM的新治疗策略。

数据来源

数据集/队列	数据库	数据类型	详细信息
GSE84465	GEO	RNA-seq数据	4个胶质母细胞瘤（GBM）样本

在这项研究中，从癌症基因组图谱（TCGA）和中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）获得了总共1528个具有相应临床信息的神经胶质瘤患者样本。随后，过滤掉缺乏基本临床信息的样本，确保队列完全由具有完整临床数据的患者样本组成，以供分析。

研究思路

基于获得的公开数据集进行生物信息学分析，采用R软件单因素Cox回归分析，评价铁死亡相关基因与患者总生存期（OS）的关系。确定本研究纳入的所有患者的风险评分，并选择中位数作为临界值，将患者分为高危组和低危组。同时，利用GBM基因表达数据，采用CIBERSORT算法计算免疫浸润细胞中22种不同基因型的相对比例。提取高变异基因进行主成分分析（PCA），前30个显著主成分进行聚类分析。最后，进行实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹分析。

主要结果

1. 铁死亡相关风险基因的鉴定

共有655个患者样本以3：2的比例分为训练集和测试集。其中，392个患者样本被分配到训练集，而263个患者样本组成了测试集。基于患者病理类型的分类涉及将WHO分类为4级的患者样本分配到 GBM 组，而属于WHO 2-3 级的患者样本被指定为非 GBM 组（表1）。

表1 基线人口统计学特征（TCGA）（部分）

使用CGGA数据集中的873个患者样本进行了独立验证。对CGGA数据集进行了类似的病理学分类，分为GBM和非GBM组，各自的基线人口统计学概述如下表2。

表2 基线人口统计学特征（CGGA）

2. 14个铁死亡相关风险基因的鉴定和验证活力

应用 Lasso-Cox 模型后，为每个病例分配一个风险评分，从而根据风险评分的中位数将患者分为高风险和低风险亚组。该验证加强了对高风险亚组中预后明显更差的观察结果，与初始分析的结果一致（图1）。

图1 TCGA队列（A-C）中神经胶质瘤患者的生存分析和CGGA队列（D-F）中的独立验证

3. 独立危险因素的识别和验证

对14个铁死亡相关风险基因与临床病理学之间关联的调查揭示了不同的分类。AURKA、RRM2、HBA1、CAPG、HSPB1、GDF15、STEAP3和NNMT 被鉴定为风险基因，表明表达水平升高可能与预后较差相关。对临床病理特征进行单因素（图2A）和多因素（图2B）Cox回归分析，分别计算风险比（HR）和95%置信区间（CI）。

图2 神经胶质瘤患者独立预后危险因素的调查

4. 临床病理亚组风险分析

对神经胶质瘤患者临床病理亚组的每个独立危险因素进行了全面的生存分析。该分析显示，在TCGA队列的各个亚组中，与低风险组相比，高风险组的OS率显着降低。具体而言，这种差异在45岁以下、45岁或以上、根据 WHO 分类分为2-3级的患者、以头痛和癫痫为初始症状的个体以及有或没有头痛和肿瘤病史的患者中很明显。这些发现强调了14个铁死亡相关风险基因在不同临床参数中对神经胶质瘤患者的潜在预测效用（图3）。

图3 每个独立危险因素组（A-I）亚型的预后分析。P值采用log-rank检验计算

5. 神经胶质瘤免疫细胞浸润分析

对神经胶质瘤内免疫细胞浸润的分析揭示了22种免疫细胞基因型的独特模式。低风险组表现出较低的巨噬细胞M1表达水平，而相反，表现出较高的巨噬细胞M2表达水平。这些差异具有统计学意义，p值低于0.05，这意味着巨噬细胞M2极化与对神经胶质瘤预后的负面影响之间存在潜在关联（图4）。

图4 神经胶质瘤中共有 22 种免疫细胞基因型浸润分析

6. 巨噬细胞的单细胞簇分析

区分高风险组和低风险组之间M1和M2巨噬细胞分布的变化促使进行了深入研究。为了更深入地研究，我们采用了GSE84465数据库，重点关注GBM中的细胞改变，使用“seurat”R包仔细检查人类原代GBM样品中的细胞类型。利用先前的文献和CellMarker网站，我们确定了三个不同的巨噬细胞簇（图5）。